تسجيل متعددة الخلايا في السلوك Myxococcus زانثس الأغشية الحيوية باستخدام الزمن الفاصل بين Microcinematography

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير مقايسة تصوير مجهري بفاصل زمني (time-lapse micros cinematography) منخفضة التكلفة وذات دقة كافية لإنتاج نتائج قابلة للتكرار والقياس الكمي. ويتم تحقيق ذلك من خلال استخدام حشوات سيليكون رخيصة الثمن وقابلة لإعادة الاستخدام لإنشاء أطباق أوساط الآغار أو شرائح مجهرية. وقد أظهرت النتائج أن مجمعات الأطباق هذه تظل رطبة ومؤكسجة بشكل كافٍ لأكثر من أسبوع عبر مجموعة متنوعة من أنواع الأوساط وتركيزات الآغار.

بالإضافة إلى ذلك، وبما أن التصوير المجهري المسرع (time-lapse micro cinematography) عملية بطيئة، فإن استخدام ثمانية مجاهر غير مكلفة يساعد في تسريع عملية الحصول على البيانات. مرحباً، أنا رايان تايلور من مختبر الدكتور روي ويلش من قسم الأحياء بجامعة سيراكيوز. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصوير أفلام المدى الزمني للأغشية الحيوية البكتيرية؛ حيث سنستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة السلوك متعدد الخلايا للأغشية الحيوية من نوع MTIs.

دعونا نبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بقياس كثافة الخلايا لمزرعة Occus sanus التي تم تحضيرها لليلة واحدة باستخدام مقياس العكارة، ثم انقل 1 mL من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2.5 mL. قم بترسيب البكتيريا وغسلها وإعادة تعليقها في وسط TPM كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق، ثم استخدم الماصة وجهاز الرج (vortex) لإعادة تعليق الراسب تماماً، وهو أمر قد يستغرق بعض الوقت. بعد ذلك، أضف 0.5 g من aros إلى 50 mL من TPM، وهو الوسط المستخدم في المقايسة.

أضف أيضاً 0.5 grams من aros إلى 50 milliliters من C-T-T-Y-E، وهي وسط القرص الغذائي الذي يتم تعقيمه بواسطة الأوتوكلاف. ثم حافظ على الوسط عند درجة حرارة 55 °C في حضانة أو حمام مائي، وذلك أثناء إعداد مقايسة التتبع.

تُجهز المعقدات في الأطباق لبدء بناء القرص الغذائي أولاً باستخدام معقم اللهب والشرائح الزجاجية والمجهر. ضع حاشية من المطاط السيليكوني المعقم بسُمك 0.5 millimeter فوق الشريحة. وبواسطة الماصة، يتم وضع حوالي 300 microliters من وسط C TT YE في الفجوة التي شكلتها الحاشية على الشريحة.

يجب على الباحث تعقيم شريحة أخرى باستخدام اللهب ثم وضعها بزاوية مائلة فوق وسط C-T-T-Y-E. إن وضع الشريحة بزاوية يمنع تكون الفقاعات. وبمجرد استقرار الشريحة في مكانها، يتم تثبيت المكونات معاً باستخدام مشابك ربط صغيرة، بمعدل مشبك واحد على كل جانب.

ضع المركب المقصوص عند درجة حرارة 4 °C واترك وسط C-T-T-Y-E agro يتصلب، وعادة ما يستغرق ذلك حوالي خمس دقائق. وبمجرد تصلب الـ agro، يمكن تحضير مركبات الأطباق المستخدمة في مقايسة التتبع.

ابدأ بتجهيز الشرائح اللازمة لإنشاء مجمعات المقايسة. قم بتعقيم شريحتين زجاجيتين للمجهر باستخدام اللهب لكل مجمع. ضع حاشية أوتوكلاف فوق إحدى الشرائح لتشكل قاعدة المقايسة.

تُستخدم الشريحة الأخرى لتسطيح حبيبات الآغار وكشريحة دعم. الجزء العلوي من المقايسة عبارة عن غطاء شريحة. أولاً، قم بلف شريحة مجهرية بشريط تسمية، ثم قم بتعقيم غطاء الشريحة الزجاجي باللهب وضعه فوق الشريحة الملفوفة والمعقمة.

قم بتحريك دعامات الشرائح المغلفة للأعلى لتدعيم غطاء الشريحة، وذلك لمنعه من التصدع. استخدم ملقطاً لوضع حشية جهاز التعقيم (autoclave gasket) فوق غطاء الشريحة الذي تم تعقيمه باللهب. اضغط لأسفل على الحشيات الموجودة على الشريحة السفلية وغطاء الشريحة للتأكد من تكوين إغلاق محكم مع الزجاج.

وإلا، فقد تجف مصفوفات الوسط الغذائي. ضع مجموعات حاشية الشريحة وحاشية غطاء الشريحة جانباً مع توجيه الجوانب المعقمة للأعلى، ومن هذه النقطة فصاعداً، اعمل على مجمع واحد فقط في كل مرة لمنع تصلب مصفوفات الوسط الغذائي، مما قد يؤدي إلى رداءة جودة الفيديو. ابدأ بوضع القرص المغذي.

أخرج مجمع القرص المغذي من درجة حرارة أربع درجات مئوية. قم بإزالة غطاء الربط وقم مسبقًا بفصل الشرائح للكشف عن وسط C-T-T-Y-E الآغار الذي تصلب الآن باستخدام ماصة عينات دقيقة ذات طرف زجاجي مخصص للاستخدام مرة واحدة بسعة 100 µL. أخرج قرصًا مغذيًا بقطر 1 ملم من وسط C-T-T-Y-E الآغار أيضًا، وضعه في التجويف الذي شكلته الحاشية على غطاء الشريحة.

ثم استخرج حلقات وسط TPM من الحاضنة وانقل 300 microliters منها بواسطة الماصة إلى الفجوة التي شكلها الحشية على غطاء الشريحة والتي تحتوي على القرص المغذي. يجب أن تتراكم حلقات وسط TPM لتسوية وسط T-P-M-S-A. ضع إحدى الشرائح التي تم تعقيمها باللهب وبدون حشية بزاوية فوق حلقات وسط TPM. يساعد وضع الشريحة بزاوية في منع تكون الفقاعات.

قم بتثبيت المجمع معاً باستخدام مشابك ربط صغيرة، واحد على كل جانب. ضع المجمع المثبت عند درجة حرارة 4 °C واترك وسط agarose ليتصلب. يستغرق هذا عادةً حوالي خمس دقائق.

بمجرد أن يتصلب الوسط المرتفع، يتم إخراج المجمع من درجة حرارة 4 °C. قم بإزالة مشابك التثبيت والضغط على طرف المجمع. لفك الشريحة الملفوفة بالشريط، قم بإزالة الشريحة الملفوفة بالشريط ووضعها على طاولة المختبر لاستخدامها لاحقاً.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط كإسفين، افصل مجمع حاشية الشريحة الغطائية ومصفوفة الوسائط عن شريحة الدعم ثم تخلص من شريحة الدعم. لا تستخدم حركة رفع قسرية لفصل مجمع حاشية الشريحة الغطائية، لأن ذلك قد يؤدي إلى كسر الشريحة الغطائية أو التصاق مصفوفة الوسائط بشريحة الدعم.

بعد إزالة شريحة الدعم، ضع مجمع مصفوفة الوسط الخاص بحاشية غطاء الشريحة على الشريحة الملفوفة بالشريط بحيث تكون جهة الحاشية للأعلى. ضع هذا المجمع بجانب موقد للسماح بتبخر جميع الرطوبة المرئية من سطح media agros المكشوف حديثاً. لا تترك media agros ليجف لأكثر من دقيقة واحدة.

بما أن هذا قد يؤثر على سلوك التجمهر لـ M Zant، انتقل إلى زرع الخلايا على مجمع المقايسة الذي تم تحضيره حديثاً. وبمجرد تبخر الرطوبة الزائدة من وسط حاشية الغطاء في مجمع media agros، اسحب 0.5 µL من الخلايا المركزة لترسيبها على media agros. اضغط على طرف الماصة قبل الاقتراب من media agros.

تظهر قطرة من الخلايا عند طرف الماصة، مما يسهل ترسيب الخلايا دون أن يلامس الطرف وسط الأغار. يمكن أن يؤدي وجود منخفض على سطح الأغار إلى تغيير سلوك سرب mz. حرك الماصة مباشرة إلى الأسفل لتوزيع الخلايا على بُعد حوالي واحد مليمتر تقريبًا من القرص المغذي المدمج.

ثم اسحب الماصة للأعلى مباشرةً. بهذه الطريقة، يتم ضمان أن يكون التجمع دائرياً. وبمجرد ترسيب الخلايا، ضع المجمع بجانب الموقد للسماح لبقعة الخلايا بالجفاف لمدة لا تزيد عن 20 ثانية.

بعد التجفيف، قم بمحاذاة مجموعة حشية الشريحة التي تشكل قاعدة المجمع مع الحشية الموجودة على الغطاء. أدخل وسط الحشية في مجمع خلية acro الذي يشكل الجزء العلوي من المجمع. اضغط بلطف معاً لتشكيل سدادة محكمة.

نظف أسطح الشريحة والغطاء الزجاجي باستخدام منديل kim wipe لإزالة أي بقايا من أجل منع التكثف. ضع المركب على منصة المجهر المسخنة فور تنظيف الشرائح، بحيث تكون الشريحة في الأسفل والغطاء الزجاجي في الأعلى. إذا حدث تكثف، فاترك مركب الشريحة على المنصة المسخنة لعدة ثوانٍ قبل بدء تشغيل برنامج الحصول على الصور.

من أجل تحضير المقطع المرئي، اختر العدسة الشيئية المناسبة، 2x أو 4x أو 10x في المجهر. قم بتشغيل الكاميرا والمجهر وتحقق من مستويات الإضاءة للتأكد من أنها ليست شديدة للغاية. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر وافتح برنامج الحصول على الصور.

انقر فوق نافذة الصورة المباشرة وقم بضبط تركيز المجهر. ستظهر الصورة بشكل مشابه لتلك الموضحة هنا. ابدأ في الحصول على الصور.

تأكد من فحص التركيز بانتظام خلال الساعة الأولى لأن آغار الوسط يميل إلى الاستقرار مما يؤدي إلى انزياح التركيز. بمجرد اكتمال عملية الحصول على الصور، قم بنقل الصور المكتسبة للتخزين. قم بتفكيك مجمع الشريحة عن طريق النقع في 90%ethanol طوال الليل أو تعقيم الحشيات بـ TOLA لإعادة استخدامها.

يُظهر هذا الفيلم بنظام التصوير الزمني (time lapse) الخلايا الخاضعة لمقايسة التتبع الموصوفة هنا. معدل الالتقاط هو صورة واحدة في الدقيقة بتكبير 20x، ومعدل التشغيل هو 60 صورة في الثانية. يُظهر هذا الفيلم بنظام التصوير الزمني مجموعة من الخلايا حيث يعبر 1% من الخلايا عن GFP.

تم تجميع المقطع المرئي عن طريق دمج صور متبادلة بين تباين الطور والصور الفلورية. أُجري الفحص على C-T-T-Y-E في 1%Aros، وكان معدل الالتقاط صورة واحدة في الدقيقة بتكبير 100 x. يوضح هذا المقطع المرئي مضاف الزمان حركة الانزلاق لـ M Anthes.

أُجري هذا المقايسة على C-T-T-Y-E في 1%Aros وكان معدل الالتقاط صورة واحدة في الدقيقة بتكبير 100 x. يوضح فيلم التصوير الزمني (TimeLapse) هذا الحركة الارتعاشية لـ P OSA. أُجريت هذه المقايسة على LB في 1%Aros وكان معدل الالتقاط صورة واحدة في الدقيقة.

عند تكبير 20 x يكون معدل التشغيل 60 صورة في الثانية. يوضح هذا الفيلم بفاصل زمني الحركة السربية لـ Smar senses. تم إجراء هذا المقايسة على LB و 1%Aris ومعدل الالتقاط هو صورة واحدة في الدقيقة.

عند تكبير 20x، يكون معدل التشغيل 60 صورة في الثانية. يظهر هذا الفيلم بنظام التصوير الزمني (time lapse) الحركة الانزلاقية لـ EGT. تم إجراء هذا المقايسة في وسط LB على agarose بتركيز 0.5%، وكان معدل الالتقاط صورة واحدة في الدقيقة، بينما بلغ معدل التشغيل عند تكبير 20x حوالي 120 صورة في الثانية نظراً لهشاشة agarose بتركيز 0.5% في وسط LB.

يستخدم هذا المقايسة الحشوات الأكبر حجماً الموضحة في الشكل 1 B. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إنتاج مقاطع فيديو بنظام التصوير المتقطع (time-lapse) للأغشية الحيوية البكتيرية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التمهل والعمل بدقة قدر الإمكان لتحقيق نتائج متسقة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.