التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

الهدف العام من التجربة التالية هو القياس الكمي لهجرة الخلايا في الوقت الفعلي باستخدام مجهر التصوير الزمني (video time lapse microscopy). يتم تحقيق ذلك من خلال طلاء طبق زراعة مكون من ستة آبار بالكولاجين أولاً، ثم استزراع الخلايا المستهدفة بكثافة منخفضة على الطبق المطلي. وكخطوة ثانية، يتم إحداث جرح في الطبق باستخدام رأس ماصة، لضمان توفر مساحة كافية للهجرة.

بعد ذلك، يتم إعداد المجهر والتقاط الصور على فترات زمنية منتظمة باستخدام نظام للتحكم في درجة الحرارة للسماح بالمراقبة المستمرة للخلايا المهاجرة في الوقت الفعلي. وفي النهاية، يُستخدم بروتوكول تتبع الجسيمات لتقييم الاختلافات في متوسط السرعة والإزاحة الكلية للخلايا التجريبية وخلايا المجموعة الضابطة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة الهجرة في غرفة التجنب، في أنها لا تعتمد على قياسات كمية للهجرة عند نقطة النهاية.

وبدلاً من ذلك، تتيح هذه الطريقة مراقبة وحساب بارامترات مختلفة بشكل مستمر. ويمكن أن تساعد هذه المنهجية في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا السرطان، مثل كيفية تأثير جينات أو أدوية معينة على هجرة الخلايا الورمية؟ قبل يومين من الإجراء، أضف 1.5 milliliters من الكولاجين المخفف في opti media إلى كل بئر من أطباق زراعة ذات ستة آبار، ثم قم بتحضين الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C قبل يوم واحد من الإجراء.

أعد تعليق الخلايا المستهدفة في 2 mL من DMEM مضاف إليه FBS لكل بئر، ثم انقل الخلايا إلى كل بئر من أطباق الكولاجين المطلية بـ ENC، مع تحضين الخلايا طوال الليل عند 37 °C. وفي يوم الإجراء، استخدم رأس ماصة لإحداث جرح في الخلايا التي تم استزراعها طوال الليل، ثم اغسل كل بئر باستخدام PBS لإزالة أي حطام تشكل نتيجة الجرح.

أضف وسط DMEM مع FBS إلى الآبار التي تم شطفها، ثم افحصها تحت المجهر للتأكد من إنشاء مساحة جرح نظيفة. بعد تشغيل كاميرا المجهر وجهاز تصوير الخلايا الحية، ضع الطبق فوق منصة المجهر. قم بتغطية الطبق بغرفة التحكم البيئية الجديدة للخلايا الحية، واضبط منظم الحرارة على 37 °C وثاني أكسيد الكربون على 5%. الآن افتح برنامج slide book من شريط القوائم.

حدد التحكم في التركيز بالنقر فوق زر F الموجود داخل الدائرة. في مربع الشيئية، استخدم النافذة المنسدلة لتحديد الشيئية. في مربع مجموعة المرشحات، اختر الإعدادات لتوجيه مسار الضوء إلى القطعة I. اختر المرشح المناسب للإضاءة ذات المجال المضيء، ثم انقر فوق فتح Bright.

لفتح غالق المجال المضيء. اختر الآن مرشح المجال المضيء الموجود على البرج وعاين العينة من خلال العدسة العينية للعثور على المجالات المناسبة ولضبط تركيز العينة. بعد ذلك، حرك برج المرشحات لتغيير مسار الضوء إلى الكاميرا. لالتقاط الصور في برنامج slide book، انقر فوق التحكم في التركيز (focus control) واختر XY لتحديد مواضع مختلفة عبر العدسة العينية، ثم انقر فوق تعيين النقطة (set point) لتثبيت كل موقع.

لالتقاط الصور، قم بضبط تركيز صورة الكاميرا المعروضة على الشاشة يدويًا، ثم استخدم الأدوات الموجودة في نافذة عناصر التحكم في التركيز لضبط موضع محور Z للمنصة. ولتحقيق أفضل النتائج، قم بالتركيز على البروزات الخلوية المسطحة القريبة من نقطة التلامس مع الطبق للمساعدة في عملية الضبط. استخدم شريط التمرير لضبط أوقات التعريض الضوئي لتكون ضمن نطاق مناسب للتركيز.

إذا تم تحديد مواضع XY متعددة، فقم بضبط التركيز لكل موضع على حدة عن طريق اختيار التحكم في التركيز (focus control)، ثم xy، ثم نقطة الزيارة (visit point). في كتاب الشرائح (slide book)، اختر الرسم البياني للكاميرا من شريط القائمة، ثم اختر نوع الالتقاط (capture type)، ثم التصوير الزمني (time lapse) لتحديد المدة الزمنية للتجربة.

من القائمة المنسدلة، أدخل التأخير المطلوب بين بداية النقطة الزمنية وبداية النقطة التالية. وفي حقول الفواصل الزمنية، سيتم حساب الحقل الثالث تلقائيًا بناءً على القيم التي يتم إدخالها يدويًا. وتحت خيار التقاط XY المتعدد (multiple XY capture)، اختر قائمة النقاط المتعددة (multi-point list) للتجارب التي تتضمن أكثر من موضع XY واحد.

أخيراً، قم بتسمية الملف لحفظه، ثم انتقل إلى التحكم في الالتقاط (capture control) واختَر خيار "متقدم" (advanced)، ثم "spool". بعد ذلك، قم بالالتقاط إلى الذاكرة والحفظ في ملف spool بعد كل نقطة زمنية. ابدأ بالنقر فوق الصورة.

من شريط قائمة كتاب الشرائح (slide book)، اختر "استيراد" (import) من القائمة المنسدلة، ثم انقر فوق "مخزن كتاب الشرائح" (slide book spool). حدد ملفات كتاب الشرائح المطلوبة الناتجة عن تجربة الهجرة لمختلف المجالات والنقاط الزمنية. افتح الملف الأول، ثم اختر "قناع" (mask) من شريط القائمة وحدد "بروتوكول تتبع الجسيمات" (particle tracking protocol) من القائمة المنسدلة.

من قائمة تتبع الجسيمات، اختر بروتوكول تتبع الجسيمات اليدوي. ستظهر نافذة تحتوي على نقاط زمنية للبداية والنهاية. ولتحليل الهجرة العشوائية، حدد القناع، ثم بروتوكول تتبع الجسيمات. ومرة أخرى، لتحديد إحداثيات مركز الجسم، اختر مركز المساحة.

انقر بعد ذلك على تتبع (track) ومتابعة. اختر الآن الإحصائيات المطلوبة لكل مسار، مثل الإزاحة ومتوسط السرعة. كما هو موضح هنا، انقر على حساب (calculate) لعرض الإحصائيات.

يظهر في هذا المربع مثال لتحليل الهجرة العشوائية مقاساً من حيث السرعة. في الرسم البياني للشعيرات (Whiskers graph)، لوحظ في هذه التجربة زيادة في متوسط السرعة في خلايا M-D-A-M-B 2 31 التي تم فيها تثبيط جين كابت للأورام. ومقارنة بخلايا M-D-A-M-B 2 31 الضابطة هنا، تم تحليل الهجرة العشوائية للخلايا من الشكل الأول من حيث إزاحة الخلايا.

مرة أخرى، أظهرت مجموعة تثبيط الجين الكابح للأورام الإجمالية زيادة في إزاحة الخلايا مقارنة بمجموعة التحكم M-D-A-M-B 2 31. في هذا المقطع المصور بمجهر الفيديو المعتمد على مرور الوقت، تم استزراع خلايا التحكم MDA MB 2 31 على الكولاجين طوال الليل. ثم التُقطت الصور على فترات زمنية مدتها ساعة واحدة لمدة إجمالية بلغت 18 ساعة أثناء الهجرة العشوائية.

لاحظ كيف تبتعد الخلايا عن مواضعها الأصلية بمرور الوقت. في هذا المقطع، تم تسجيل وتحليل هجرة خلايا M-D-A-M-B 2 31 المختبرة بعد زراعتها طوال الليل على الكولاجين. لاحظ أن الخلايا المختبرة أكثر قدرة على الهجرة مقارنة بالخلايا الضابطة في المقطع السابق.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل غزو الخلايا وdynas للإجابة على أسئلة إضافية، مثل: ما هي أدوار الخلايا في النقائل السرطانية بعد تطورها؟ لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف هجرة الخلايا باستخدام خطوط خلايا سرطانية معزولة.