مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

تُعد الأشواك التغصنية بروزات غشائية تمتد من تغصنات العصبون وتستقبل المدخلات التشابكية. ويحدث استطالة هذه الأشواك أو انكماشها أو ظهورها أو اختفاؤها استجابةً للتغيرات في وظيفة الشبكة العصبية الناتجة عن أنماط محددة من النشاط العصبي. تُعرف هذه الظاهرة باللدونة القشرية، والتي تهدف لمراقبة التغيرات المورفولوجية في الأشواك التغصنية.

في الحيوانات الحية، يتم تثبيت لوحة تصوير على جمجمة الفأر. يتم ترقيق منطقة من الجمجمة جراحيًا، وتُؤخذ صور بتكبير منخفض وعالٍ. ثم يتم إعادة تصوير هذه المناطق في نقاط زمنية لاحقة.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أنه يمكن تصور مورفولوجيا الأشواك التغصنية بوضوح باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة في نقاط زمنية متعددة. كما أن مورفولوجيا الأشواك تتسم بمرونة عالية، حيث تظهر تغيرات في البنية بالإضافة إلى ظهور واختفاء الأشواك التغصنية. مرحباً، أنا إميلي كيلي من مختبر أنايا ماكا في قسم البيولوجيا العصبية والتشريح بجامعة روتشستر.

سنعرض لكم اليوم إجراء التصوير المزمن للقشرة البصرية للفأر بعد تحضير يُعرف بـ "fins". نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة معدل تجدد الأشواك الشجيرية. لذا، لنبدأ.

ابدأ الإجراء بتعقيم الأدوات المستخدمة في الجراحة العقيم. ثم قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70%ethanol وغطِ سطح العمل بضمادة نظيفة. راقب عمق التخدير في فأر مخدر بمزيج الفنتانيل عبر اختبار استجابته لقرص الإصبع؛ الفأر الموضح هنا هو فأر معدل وراثياً A-G-F-P-M يتم فيه التعبير عن GFP.

في الطبقة الخامسة، تبرز الخلايا بجانب الهرمية (parametal cells) استطالات شجيرية نحو الطبقات السطحية. وللحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37.5 درجة Celsius، يُوضع الحيوان على بطانية تدفئة مع مراقبته بواسطة مقياس حرارة شرجي متصل. بعد ذلك، يُوضع مرهم للعين على العينين لمنع جفافهما باستخدام مقص.

قم بإزالة الشعر من الجزء الخلفي لرأس الفأر، من المنطقة خلف الأذنين وصولاً إلى العينين. بعد ذلك، نظف الجزء العلوي من رأس الحيوان بوضع 70% ethanol، يليه فرك بمحلول Betadine ثم غسل بمحلول Betadine. قم بإجراء شق LCU خلف الأذنين وبمحاذاة الجانب الأيمن أو الأيسر من الخط الناصف، بناءً على نصف الكرة المخية المراد تصويره، وصولاً إلى العينين، ثم اطوِ الجلد بعيداً عن موقع الجراحة.

لا تقم بإزالة الجلد لأنه سيتم خياطته لاحقاً باستخدام ملاقط دقيقة. اسحب الجلد برفق للأعلى وبعيداً عن المنطقة المراد فحصها. وباستخدام ملاقط نظيفة، قم بكشط السمحاق برفق من المنطقة المكشوفة من الجمجمة.

ضع كمية صغيرة من كلوريد الحديد بنسبة 10% على الجمجمة لتجفيف غشاء السمحاق تماماً والتأكد من إزالته بالكامل. من الضروري أن تكون الجمجمة جافة تماماً. ولضمان التصاق الغراء بشكل صحيح، قم بكشط غشاء السمحاق المجفف برفق باستخدام شفرة جراحة مجهرية.

بعد ذلك، ضع طبقة رقيقة من غراء Sano الأكريليكي حول نافذة التصوير في لوحة الرأس المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، ثم قم بتثبيت اللوحة على الجمجمة. وباستخدام الطرف الخشبي لعصا مسحة قطنية، ضع الغراء على الدرزات الداخلية لنافذة التصوير، مع التأكد من ملء جميع الفجوات بين لوحة التصوير وانحناء الجمجمة. ثم ضع قطرة من مُسرع جفاف الغراء داخل النافذة.

بعد ذلك، قم بمسح الكمية الزائدة بسرعة. اترك الغراء ليجف حتى يجف تماماً. وباستخدام مثقاب أسنان مثبت عليه ريشة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.7 millimeter، ابدأ في ترقيق الجمجمة في نافذة التصوير.

قم بالتبديل بين الحفر والتطبيق المتقطع لمحلول ملحي معقم بتركيز 0.9%، وذلك لتجنب توليد حرارة زائدة على الجمجمة. قم بترقيق نافذة بمقاس 4×4 مليمتر على الجمجمة باستخدام ضربات صغيرة عبر سطح الجمجمة.

باستخدام المثقاب السني، يتم اختبار مدى رقة الجمجمة باستخدام ملقط ذو طرف غير حاد؛ حيث سيحدث انبعاج طفيف في سطح الجمجمة عند تطبيق ضغط خفيف.

يتراوح سمك الجمجمة الأمثل للتصوير بين 10 و 30 ميكرون. وبمجرد ترقيق الجمجمة، قم بتنظيف نافذة التصوير من جميع الشوائب ووضع المحلول الملحي على الجمجمة. ثم قم بتصوير نافذة التصوير باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على مجهر تشريحي.

ستساعد الأوعية الدموية الدماغية في هذه الصورة في تحديد الموضع المناسب لوضع لوحة التصوير في جلسات التصوير اللاحقة. انقل الحيوان إلى منصة التصوير ثنائي الفوتون. يجب أن يظل الحيوان على بطانية التدفئة، مع مراقبة درجة حرارة الجسم باستمرار طوال جلسة التصوير.

مجهر ثنائي الفوتون مزود بليزر mi tai. يتم استخدام مضخة حالة صلبة بقدرة 10 watt لتحقيق أقصى قدر من الطاقة، ووحدة confocal من طراز Olympus flow view معدلة. النظام مُحسَّن للتصوير العميق للأنسجة، وقد تم تركيب كواشف خارجية في أقرب نقطة ممكنة من العدسة الشيئية للسماح بأقصى قدر من الكشف عن الفلورة في الدماغ؛ أضف قطرة من المحلول الملحي إلى نافذة التصوير باستخدام تكبير رقمي منخفض.

حدد منطقة تحتوي على عصبونات مصبغة بوضوح باستخدام كاميرا رقمية مثبتة بالمجهر. بعد ذلك، التقط صورة لمنطقة التصوير. يعد هذا الإجراء ضرورياً للعودة إلى نفس موقع التصوير في نقطة زمنية لاحقة.

قم بالحصول على مجموعة من الصور بتكبير منخفض تشمل كامل المدى المرئي للدماغ لإظهار مدى التفرع الشجيري. سيتم استخدام هذه الصور لتحديد منطقة التصوير في النقاط الزمنية اللاحقة، حيث تحافظ كل من الأوعية الدموية والزوائد الشجيرية على بنيتها في الحيوانات الصغيرة والبالغة باستخدام برنامج التصوير.

قم بزيادة التكبير الرقمي ثماني مرات، واضبط إحداثيات XY إذا لزم الأمر، ثم قم بتجميع مكدس (stack) بتكبير عالٍ، وهو ما سيظهر المورفولوجيا الشجيرية المفصلة بما في ذلك مواقع وبنية الأشواك الشجيرية. دوّن ملاحظات تفصيلية بخصوص كل عملية تجميع مكدس، بما في ذلك إحداثيات التحريك (pan coordinates)، ونطاق التجميع، وحجم خطوة Z، وعدد الخطوات في المكدس. ستُستخدم هذه الملاحظات عند العودة إلى هذه الشجيرة أو المحوار في نقطة زمنية لاحقة.

بعد التصوير، قم بإزالة صفيحة الرأس عن طريق فصلها برفق عن سطح الجمجمة باستخدام الملقط. قم بإزالة أي بقايا غراء وامسح الجمجمة بمحلول ملحي معقم بتركيز 0.9%.

قم بخياطة الجلد فوق الجمجمة باستخدام خيط خياطة رقم 6. امسح المنطقة بـ 70% ethanol بعد الانتهاء من إجراء التصوير. ضع الحيوان في قفص نظيف تحت مصباح حراري حتى يستيقظ ويستعيد قدرته على الحركة.

بعد ذلك، أعد الحيوان إلى قفصه الأصلي لتصويره مرة أخرى في نقطة زمنية لاحقة، تتراوح من يومين إلى عدة أشهر، ثم قم بإزالة الغرز وإعادة فتح الجلد في منطقة الرأس. وباستخدام طرق معقمة، استعن بالصورة الرقمية للأوعية الدموية في الدماغ التي تم التقاطها أثناء الجراحة الأولى لتحديد موقع التصوير الأصلي. ثم أعد تثبيت لوحة الرأس كما فعلت سابقاً.

استخدم شفرة جراحة مجهرية لترقيق أي عظم قد يكون قد نما مجددًا بين الفترات الزمنية للتصوير برفق إذا لزم الأمر. قم بالترقيق باستخدام مثقاب أسنان، ونظف نافذة التصوير من الحطام ثم ضع قطرة من 0.9%sterile saline. انقل الحيوان إلى مجهر فوتوني ثنائي (two photon microscope) وحدد منطقة التصوير الأصلية باستخدام الصورة الفلورية الرقمية التي تم التقاطها خلال الجلسة السابقة.

ابدأ تشغيل برنامج عرض التدفق. افتح الصورة الأصلية ذات التكبير المنخفض، وثبّت ورقة شفافة على شاشة الكمبيوتر وارسم نمط الأوعية الدموية الرئيسية باستخدام قلم شفاف. بعد ذلك، افتح الصورة المباشرة وأعد محاذاة الأوعية الدموية لتتطابق مع النمط المرسوم على الفيلم الشفاف.

قم بإزالة الورقة الشفافة لإعادة تصوير التراكيب المكبرة بمقدار 8 مرات. افتح مجموعة الصور المكدسة (stack) المطلوبة التي تم جمعها من جلسة التصوير السابقة. ارسم التراكيب على فيلم شفاف مثبت على شاشة الكمبيوتر.

قم بتكبير الصورة الحية بمقدار ثمانية أضعاف وقم بمحاذاة الصورة مع الشريحة الشفافة. وبناءً على دقة محاذاة الموقع عند التكبير المنخفض، قد يكون من الضروري أيضاً ضبط زاوية الصورة قليلاً؛ قم بتعيين إحداثيات التحريك وفقاً لمعايير التصوير لليوم الأول، بما في ذلك حجم الخطوة وعدد الصور التي سيتم جمعها في مجموعة الـ Z-stack. يمكن إجراء إعادة التصوير مرتين، ويجب الحد من عدد مرات فتح فروة الرأس لتجنب الإخلال بسلامة الجمجمة، مما سيؤدي إلى ضعف دقة التصوير في الفئران التي تعبر عن GFPM.

تم تصوير مجموعة فرعية من خلايا الطبقة الخامسة حول الهامشية والزوائد الشجيرية المقابلة لها باستخدام المجهر الليزري الماسح ثنائي الفوتون في الجسم الحي، وتظهر هنا الزوائد الشجيرية للقشرة البصرية الموسومة ببروتين GFP. هذه الصورة هي مسقط لصورة واحدة تم الحصول عليها كل 5 microns من الـ PIA وصولاً إلى عمق نهائي قدره 175 microns. تظهر المنطقة المحددة بإطار هنا بتكبير أعلى في اليوم صفر، ومرة أخرى في اليوم الرابع هنا، مع مقارنة لصورة فرع شجيري بتكبير أعلى من اليوم صفر واليوم الرابع.

توضح هذه الصور الأشواك المستقرة التي تشير إليها رؤوس السهام البيضاء، والأشواك التي تلاشت وتراجعت والتي تم تمييزها برؤوس سهام حمراء، والأشواك الجديدة التي يشير إليها رأس السهم الأخضر. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التصوير المزمن بفوتونين في القشرة البصرية للفأر باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي عناية خاصة أثناء عملية الترقيق لتجنب إتلاف الجمجمة والأم الجافية الموجودة أسفلها، لأن ذلك سيؤدي إلى ضعف دقة التصوير، كما يجب تدوين ملاحظات تفصيلية.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.