إجراء جراحة حج القحف لتصوير الدماغ المزمن

تزداد أهمية تقنيات التصوير بشكل مستمر في دراسة وظائف الدماغ. ومن بين هذه التقنيات، برز مجهر الليزر ثنائي الفوتون كوسيلة مفيدة للغاية لأنها تسمح بدراسة الدماغ الحي مع التحضيرات المناسبة. وتتيح هذه التقنية مراقبة نفس المنطقة القشرية بشكل مزمن لفترات تتراوح من دقائق إلى أشهر.

في هذا الفيديو، نعرض طريقة تحضير للتصوير الحي المزمن للدماغ باستخدام المجهر الضوئي ثنائي الفوتون. كان الدكتور Carl Voda، الباحث في معهد Howard Hughes الطبي في Janelia Farm، هو الرائد في ابتكار تحضير النافذة القحفية الذي سنقوم بشرحه اليوم. مرحباً، أنا Ricardo must من مختبر Carlos Porter Cayo في قسم أمراض الأعصاب بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس.

سنعرض لكم اليوم إجراء إنشاء نافذة قحفية للتصوير المزمن داخل الجسم الحي. يعد هذا التحضير مفيدًا جدًا لأنه يسمح بتصوير مناطق عميقة داخل الدماغ باستخدام مجهر الليزر ثنائي الفوتون. لذا، فلنبدأ العملية.

قبل البدء في الجراحة، يتم تخدير الفئران باستخدام isof fluorine بنسبة 4% للتحريض، ومن 1.5% إلى 2% أثناء الجراحة، وذلك باستخدام الإجراءات المعتمدة من I-A-C-U-C؛ ومن المهم استخدام قرصات الذيل و/أو أصابع القدم للتأكد من تخدير الحيوان بالكامل. وباستخدام أداة تشذيب القوارض، يتم حلاقة الشعر من مؤخرة الرقبة وصولاً إلى العينين.

بعد عملية الحلاقة، يوضع الفأر على إطار التوجيه المجسم (stereotaxic frame)، مستنداً على بطانية لإعادة تدوير المياه مضبوطة عند 37 درجة Celsius، ويتم تثبيت الرأس بإحكام باستخدام قضبان الأذن. ثم يوضع مرهم للعين لمنع جفاف عين الحيوان. بعد ذلك، يتم حقن الديكساميثازون بجرعة 0.2 milligrams per kilogram والكاربروفين بجرعة five milligrams per kilogram تحت الجلد.

وذلك لمنع تورم الدماغ أو حدوث استجابة التهابية على التوالي. قبل البدء في الجراحة، تأكد من تعقيم منطقة العملية عن طريق مسح الجلد بثلاث مسحات متبادلة من 70%alcohol وBetadine. لقد تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية مسبقاً باستخدام جهاز تعقيم بالخرز الزجاجي، مع استخدام مقصات رُشت بـethanol.

يتم إزالة الجلد الذي يغطي الجزء العلوي من الجمجمة، بدءاً بشق أفقي على طول قاعدة الرأس، يليه شقّان في الاتجاه المنخاري، بحيث يصلان تقريباً إلى الجفون. ثم يتم إجراء شقين مائلين يلتقيان عند الخط الناصف. عند هذه النقطة، يتم وضع قطرة من محلول lidocaine و epinephrine على السمحاق لتجنب النزيف المفرط أو الألم، وباستخدام المشرط، يتم إزاحة السمحاق نحو حواف الجمجمة.

يتم أيضًا إبعاد عضلات مؤخرة الرقبة برفق. بعد ذلك، يتم كشط كامل المنطقة المكشوفة من الجمجمة بلطف باستخدام مشرط لإنشاء سطح جاف. يعد هذا الأمر مهمًا جدًا لأنه سيسمح للصمغ بالالتصاق بشكل أفضل عند تطبيقه لاحقًا.

بمجرد اختيار موقع التصوير، يصبح الباحث مستعداً لإنشاء النافذة القحفية أولاً. يتم رسم دائرة يبلغ قطرها حوالي 4 mm برفق باستخدام مثقاب أسنان يعمل بضغط الهواء. وبعد الحفر قليلاً، يتم وضع محلول lidocaine epinephrine مرة أخرى على سطح الجمجمة.

يتم إيقاف الحفر عندما تتبقى طبقة رقيقة جداً من العظم، عادة ما تكون بسمك ورقة واحدة. يتم الوصول إلى هذه المرحلة عن طريق الضغط بلطف على مركز فتحة الجمجمة للشعور بمدى استجابتها تحت قطرة من المحلول الملحي، والاستفادة من الترابيق العظمية، وهي بنية إسفنجية للعظم.

يتم رفع قطعة فتحة الجمجمة بعيدًا عن الجمجمة باستخدام ملقط ذو طرف رفيع جدًا. ويعد المحلول الملحي مهمًا لأنه يساعد في رفع الجمجمة ويمنع نزيف الأم الجافية. بعد ذلك، يتم وضع رغوة هلامية كانت قد نُقعت مسبقًا في المحلول الملحي على الأم الجافية لوقف أي نزيف بسيط قد يحدث أحيانًا عند إزالة الجمجمة.

بعد تجفيف سطح الأم الجافية والتأكد من عدم وجود نزيف، تُوضع شريحة زجاجية غطائية معقمة بحجم 5 مم برفق فوق الأم الجافية. ثم تُوضع قطرة من غراء يعتمد على السيانوأكريليت على نصف الكرة المخية المقابل في الجمجمة. وبمساعدة إبرة، يُوزع الغراء بلطف حول النافذة مع الحرص على عدم وضعه تحت الزجاج.

يمكن الآن وضع الغراء في طبقة رقيقة على كامل سطح الجمجمة. وبمجرد جفاف الغراء، يتم خلط الأكريليك السني وتطبيقه على كامل سطح الجمجمة، مع تغطية حافة صغيرة من غطاء الشريحة (cover slip) لتثبيته. وبعد تثبيت غطاء الشريحة، يتم عمل بئر صغير حول النافذة باستخدام الأكريليك السني.

يتم أيضاً دمج قضيب من التيتانيوم في الأكريليك السني. سيُستخدم هذا القضيب لاحقاً لتثبيت الفأر بإحكام على منصة المجهر. ومن أجل التصوير، من المهم التأكد من أن القضيب مستوٍ بحيث يكون موازياً للنافذة القحفية.

يمكن أن يسمح وضع قطعة من الورق تحت القضيب ببقائه مستويًا أثناء تصلب الأكريليك؛ يُترك أكريليك الأسنان ليتم معالجته أو يتصلب لمدة 10 دقائق، وعندها يكون قد تم تثبيت القضيب التيتانيوم في مكانه. يوضع الحيوان بعد ذلك في قفص دافئ حتى يتماثل للشفاء. وبعد الإفاقة من التخدير، يمكن تصوير الحيوان في اليوم نفسه.

يعرض هذا المقطع سلسلة مكونة من 160 صورة تم التقاطها بفواصل زمنية قدرها خمسة ميكرون باستخدام مجهر فوتوني ثنائي مخصص، وذلك عبر نافذة قحفية وضعت فوق القشرة الحسية الجسدية لفأر GFPM يبلغ من العمر ثلاثة أشهر. يعبر هذا الخط المعدل وراثياً من الفئران عن البروتين الفلوري الأخضر GFP في مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية الهرمية. وفي الطبقة الخامسة والطبقتين الثانية والثالثة، تم التقاط الصور باستخدام عدسة شيئية غمر مائي بقوة 40x وفتحة عددية 0.8، وباستخدام طول موجي للإثارة يبلغ 910 نانومتر.

في الصور الأكثر سطحية، يسهل التعرف على التشجرات الشجيرية للزوائد الشجيرية القمية للخلايا الجنيبية. وتتقارب الخصلة القمية للزوائد الشجيرية لكل عصبون في زائدة شجيرية قمية واحدة كبيرة. كما يمكن رؤية زوائد شجيرية مائلة أصغر تنبثق من هذه الزائدة القمية الرئيسية، وتظهر أيضاً محاور عصبية تعبر مجال الرؤية.

هذه مجموعة مكونة من 12 صورة تم التقاطها كل 1.5 ميكرون باستخدام نفس الشيئية 40x بتكبير أعلى، حيث تظهر تغصنات سطحية بدقة عالية تكفي لتمييز الأشواك التغصنية الفردية. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء تحضير نافذة قحفية للتصوير المزمن للدماغ باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. وتعد هذه الطريقة قوية للغاية لدراسة الدماغ لأنها تتيح لكم دراسة كل من بنية ووظيفة الدماغ الحي، ليس فقط في تصوير واحد، بل وبشكل مزمن من خلال عمليات تصوير متعددة على مدى أشهر.

تتمثل ميزة أخرى لتحضير النافذة القحفية في إمكانية تصوير مجال رؤية واسع، مما يجعل من الممكن تصوير هياكل كبيرة مثل عصب بصري كامل أو الشجرة الوريدية على مدى عدة مليمترات. عند القيام بهذا الإجراء، من المهم تذكر العمل في أنظف وأكثر الظروف تعقيماً قدر الإمكان، والحفاظ على ثبات اليد بشكل كبير. حسناً، هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.