متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

إن التعبير عن المراسلات الفلورية في الحيوانات المعدلة وراثياً يجعل من الممكن تتبع الاستجابات الخلوية للمداخلات التجريبية في نماذج الأمراض الحية. هنا، يتم تحفيز فقدان الخلايا بشكل انتقائي دوائياً في سمك الزيبرا، مع التقاط صور بؤرية متعددة الألوان عالية الدقة. يتم الحصول على صور للخلايا المستهدفة والجيران المباشرين قبل وبعد العلاج الدوائي مباشرة، وبفواصل زمنية تالية له؛ ويوضح تحليل الصور تنشيط مجموعات الخلايا الجذعية الداخلية وما يعقب ذلك من استبدال للخلايا المستهدفة خلال مرحلة التعافي.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا التجديد، مثل ما هي الآليات الخلوية والجزيئية المستخدمة لتجديد أنواع خلوية محددة. ابدأ بنقل البيوض المعدلة وراثياً التي تم جمعها من عمليات التزاوج إلى طبق بيتري يحتوي على محلول 0.3 x danio بعد 16 ساعة من الإخصاب. أضف PTU لتثبيط نشاط إنزيم tyrosine ACE قبل ظهور أي دليل على التصبغ في النسيج المستهدف. إذا لم يكن الجنين أمهقاً، قم بتحضين الأجنة عند 28.5 درجة مئوية.

بمجرد ظهور البروتينات المراسلة، ضع طبق بتري تحت مجهر ستيريو زووم فلوروسنتي وقم بفرز الأجنة بناءً على تعبير الجين المنقول المطلوب. قبل التصوير، قم بتحضير محلول تثبيت aeros منخفض الانصهار بتركيز 0.5% في وسط الأجنة واحفظه عند درجة حرارة 40 degrees Celsius.

أضف trica وPTU عند الضرورة. امزج المكونات برفق وأعدها إلى درجة حرارة 40 درجة مئوية. خدر الأسماك بوضعها في وسط أجنة يحتوي على trica.

ستصبح الأسماك غير مستجيبة لمدة ثلاث دقائق تقريباً. وللمسها باستخدام ماصة دقيقة، اسحب كل سمكة على حدة إلى طرف ماصة مقصوص في حجم يبلغ حوالي 30 microliters من المحلول المخدر. بعد ذلك، اقلب الماصة واسمح للسمكة بالاستقرار في القاع.

المس طرف الماصة بمحلول التثبيت واتركه ينتقل بفعل الجاذبية. احذر من تخفيف مادة الـ agro لضمان إمكانية إعادة استخدامها. تخلص من محلول التخدير المتبقي في الماصة الدقيقة.

بعد ذلك، وباستخدام نفس الطرف، انقل السمكة إلى طبق بتري. وفي حوالي 30 µL من محلول التثبيت، قم بتوجيه السمكة بلطف بحيث تكون المنطقة المراد دراستها متمركزة في قطرة الـ aeros. تأكد من بقاء السمكة في الوضعية المطلوبة حتى يتصلب الـ aeros.

يمكن تثبيت عدة أسماك في طبق بتري واحد إذا لزم الأمر. بعد تصلب مادة الـ aeros، انقل الأسماك إلى منصة المجهر البؤري (confocal microscope) وأضف بلطف وسط الأجنة الذي يحتوي على trica مع أو بدون PTU إلى الطبق حتى تغمر الأسماك تماماً. افتح برنامج التصوير وركز على المنطقة المستهدفة للحصول على أفضل تصوير للتفاصيل الخلوية و/أو الجزيئية.

استخدم عدسات شيئية ذات مسافة عمل طويلة وفتحات عددية عالية في البرنامج. اختر الفلتر المناسب من القائمة الدوارة. انقر فوق إعدادات الطيف وقم بإجراء التعديلات على نطاقات الانبعاث.

للحصول على فصل نظيف لإشارات المراسل وزيادة نسب الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد، اختر الشيئية المناسبة من القائمة المنسدلة لضمان ضبط الإعدادات المسبقة المحددة في البرنامج بشكل صحيح. ولتركيز الليزر وتحديد مستويات الطاقة، اختر مخرجاً من جدول البحث يظهر تشبع البكسل لكل قناة.

بعد ذلك، اضبط حساسية الكاشف للحصول على جودة الصورة المطلوبة، وارفع خرج الليزر تدريجياً حتى تصبح كثافة الصورة مقبولة. تجنب تشبع البكسلات في المنطقة المستهدفة وحافظ على مستويات الليزر في أدنى حد ممكن، وذلك لتقليل مشكلات التبييض الضوئي والسمية الضوئية.

تأكد من أن كل خط ليزر ينتج إشارة قابلة للكشف في القناة المناسبة فقط عن طريق تشغيل وإيقاف تشغيل الليزرات يدويًا مع مراقبة جميع قنوات التصوير. في حال عدم وجود تداخل في الإشارات، يمكن الحصول على جميع القنوات في وقت واحد. بعد ذلك، قم بتأطير المنطقة ذات الأهمية باستخدام وظائف التكبير والتدوير.

ثم قم بضبط سرعة المسح وحجم الصورة؛ حيث تؤدي سرعات المسح الأعلى إلى تقليل زمن بقاء الليزر وزيادة الدقة الزمنية. اضبط حجم خطوة البعد Z وفقاً للاحتياجات التجريبية. في هذه التجربة، تم استخدام حجم خطوة قدره 10 microns لتصوير سبعة مقاطع بصرية لأنسجة الشبكية.

بمجرد تحديد الإعدادات المناسبة، يتم التقاط صور Zack وحفظها. ثم يتم الانتقال إلى السمكة التالية. ويمكن إجراء التصوير المتسلسل بطريقة الصيد والإطلاق لتتبع التغيرات الخلوية على مدار أيام متتالية وفقاً للتعليمات الواردة في المستند المكتوب المرفق.

عند إجراء تجربة تصوير متعددة المراسلين، يفضل استخدام فلوروفورات مفصولة طيفياً بشكل جيد، ومع ذلك، فإن هذا الأمر ليس عملياً دائماً. نعرض هنا طريقة بسيطة لطرح الصور باستخدام برنامج Image J مفتوح المصدر لفصل الفلوروفورات ذات ملفات الإثارة والانبعاث المتداخلة. وفي حالتنا هذه، تم استخدام GFP و YFP.

استُخدمت تقنيات التصوير الزمني الموضحة في هذا الفيديو لمراقبة الخلايا الجذعية الشبكية المسمى ببروتين GFP أثناء استئصال وتجديد العصبونات ثنائية القطب في الشبكية. ولإجراء الفصل الطيفي، يتم جمع الصور باستخدام أنماط التصوير المتسلسل وإعدادات مرشح حاجز متغيرة، مما يسمح بالحصول على الفلوروفورات المتداخلة بشكل مستقل وفصلها جزئياً على التوالي. وبمجرد الحصول على الصور، استخدم أداة استيراد loci bio في برنامج ImageJ لفتح ملفات الصور وبدء أداة الاستيراد. ثم اسحب الملف المطلوب إلى نافذة ImageJ.

قم بتقسيم القنوات إلى مجموعات مستقلة باستخدام خانة اختيار "split channels" في نافذة الاستيراد لبدء تشغيل إضافة align three TP. انقر فوق plugins، ثم align stacks، ثم align three tp.

يجب محاذاة المجموعات لضمان عملية طرح صحيحة. اختر المجموعة المرجعية من قائمة الخيارات المنسدلة الأولى والمجموعة غير المحاذية من القائمة الثانية. حدد مربعي "use XY relative origin" و"use Z relative origin" ثم انقر فوق موافق.

لبدء عملية المحاذاة، انقر فوق زر تسجيل الحجم (volume registration). ستظهر نافذة جديدة تحتوي على معايير المحاذاة. انقر فوق موافق.

لقد تم تحسين هذا القسم بواسطة موزع المكون الإضافي، لذا لا يلزم إجراء أي تعديلات. عند الانتهاء، ستظهر نافذة المجموعات المتراصة المحاذات. اختر المخرجات من النافذة المحاذات لفتح نافذة المخرجات.

هذه النافذة مُحسَّنة أيضاً ولا تتطلب أي تعديل. انقر موافق. ستظهر مجموعة جديدة في مساحة العمل مع إضافة كلمة aligned إلى نهاية عنوان الملف.

لإزالة التداخل باستخدام حاسبة الصور، انقر فوق "process" ثم "image calculator". اختر المكدس المراد طرحه من القائمة المنسدلة "image one"، والمكدس الذي سيُستخدم في عملية الطرح من القائمة المنسدلة "image two". ثم اختر "subtract" من القائمة المنسدلة الخاصة بالعملية "operation" وانقر فوق "okay".

سيطلب برنامج Image J معالجة المكدس. اختر نعم. يجب أن يظهر مكدس جديد تم فيه إزالة التداخل (crosstalk) بين القنوات المتداخلة.

قم بدمج المجموعات لإعادة بناء نفس هيكل الصورة قبل عملية المحاذاة والطرح. ومن خلال تحديد القنوات المدمجة في نافذة أدوات القنوات، تتيح هذه الأداة دمج ما يصل إلى أربع مجموعات في مجموعة فائقة (hyper stack). وأخيراً، قم بتلوين القنوات وضبط السطوع والتباين، ثم احفظ الملفات بصيغة tiffs لفحص الفقد الموجه وتجدد إنزيم nitro reductase.

خلايا ثنائية القطب في الشبكية تعبر عن M cherry. تم التقاط سلسلة زمنية من الصور البؤرية في أسماك zebrafish فردية قبل المعالجة. يظهر تعبير فسيفسائي لمراسل YFP المرتبط بالغشاء في الخلايا ثنائية القطب الضابطة باللون الأصفر، وبروتين اندماج nitro reductase cherry في الخلايا ثنائية القطب المستهدفة باللون الأحمر.

يوفر الجين المنقول CFP المرتبط بالغشاء، والموضح باللون السماوي، معلومات سياقية حول معظم الخلايا الشبكية الأخرى لمزيد من الوضوح. تظهر الصورة نفسها بدون إشارة CFP بعد المعالجة بـ metronidazole. نلاحظ فقدان الخلايا ثنائية القطب التي تعبر عن nitro reductase باللون الأحمر، بينما تظل الخلايا ثنائية القطب الضابطة باللون الأصفر سليمة.

يوضح هذا الطبيعة عالية التحديد لمنهجية الاستئصال هذه. ومرة أخرى، تُعرض الصورة نفسها بدون CFP من أجل الوضوح. وعند إزالة metro NIAZ، تعود الخلايا التي تعبر عن NTR هنا.

يوضح هذا الشكل مثالاً على طريقة طرح G-F-P-Y-F-P في خلايا Mueller المحددة بـ GFP. تظهر خلايا GL باللون الأخضر وتظهر الخلايا ثنائية القطب المحددة بـ YFP باللون الأرجواني. وينتج عن التداخل بين الاثنين اللون الأبيض لإجراء عملية الطرح.

يجب أولاً محاذاة صور GFP وYFP. تسمح عملية الطرح بعد ذلك بإزالة الخلايا ثنائية القطب المسمى بـ YFP من صورة GFP، مما يتيح تمثيل خلايا Mueller المسمى بـ GFP بشكل واضح والكشف عن خلايا Mueller الأكثر خفوتاً. ويمكن الآن التحقق من التداخل بين خلايا Mueller الخافتة، وggl، والخلايا ثنائية القطب المسمى بـ M cherry والموضحة باللون الأحمر.

تشير البيانات الموضحة هنا إلى أن استئصال الخلايا ثنائية القطب يحفز خلايا glia mullar على استبدال الخلايا المفقودة. ويتماشى هذا التفسير مع الدراسات الحديثة حول تجدد الشبكية، والتي تشير إلى أن خلايا Mueller Ggl تعمل كخلايا سلفية ناتجة عن الإصابة في كل من الثدييات والأسماك. وتسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف الآليات التي تنظم تجدد أنواع محددة من الخلايا من خلال تصور الخلايا الجذعية في سمك الزيبرا.