الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد الأهداف الجينومية لـ KDM5A (المعروف بـ Jarid1A)، وهو إنزيم نزع ميثيل الهستون RBB2. ويتحقق ذلك من خلال تحضير كروماتين متقاطع يتم تعريضه للموجات فوق الصوتية لإنتاج قطع DNA بالحجم المناسب كخطوة ثانية. ثم يتم ترسيب قطع DNA المرتبطة بـ RBB2 مناعيًا باستخدام أجسام مضادة لـ RBB2.

بعد ذلك، يتم تضخيم الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) المسترجع بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لغرض التسلسل. وأخيراً، يتم محاذاة القراءات القصيرة الناتجة عن تسلسل Illumina بشكل فريد مع الجينوم البشري، ثم يتم تحديد القمم ذات الدلالة وتوصيفها بربطها بأقرب الجينات. ومن أجل تحديد Rbbb two، يتم الحصول على نتائج لجينين مستهدفين تظهر الوظائف الجزيئية المرتبطة بجيني Rrb B two المستهدفين بناءً على التحديد الشامل للجينوم للمناطق المخصبة لـ Rbbb two.

مرحباً، أنا مايك، من مختبر الدكتورة إليزابيث بنسيا في قسم الكيمياء الحيوية والوراثة الجزيئية بجامعة إلينوي في شيكاغو. وأنا آلا من مختبر الجينوميات الطبية الحيوية بقيادة الدكتورة إن جي إيه في مجمع برشلونة للأبحاث الطبية الحيوية بجامعة بومبيو فابرا.

وأنا دانييل دال. وأنا ويليام ريختر. وكلانا نعمل أيضاً في مختبر بنفولنس للمهارات.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لعملية الترسيب المناعي للكروماتين والتسلسل. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة موقع ارتباط البروتين histone demethylase. لذا، فلنبدأ.

لبدء هذا الإجراء، قم بزراعة ما يقرب من 10⁸ من الخلايا لكل عملية ترسيب مناعي أو ip. هنا، نستخدم خلايا الليمفوما العظمية المنتشرة.

تُستخدم خلايا U 9 37 ويتم تحفيزها للتمايز أحادي النواة باستخدام TPA لمدة 96 ساعة بعد نمو الخلايا، ثم يُضاف محلول الفورمالديهايد مباشرة إلى الوسط بتركيز نهائي قدره 1%. بعد ذلك، يتم تدوير القارورة لفترة وجيزة وتُترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم يتم سحب الوسط وشطف الخلايا بـ 15 milliliters من PBS المبرد بالثلج. تُكرر عملية الغسل هذه مرة واحدة.

بعد ذلك، أضف 6 mL من محلول التحلل المنظم (lysis buffer one) إلى كل قارورة على الثلج. ثم قم بهز القوارير لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. وأخيراً، قم بحصد الخلايا باستخدام كاشطة الخلايا وانقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 15 mL.

في هذه المرحلة، يمكن تخزين الخلايا عند درجة حرارة -80 °C. وإذا كانت الخلايا مجمدة، فيجب إذابتها. وبمجرد الإذابة، يتم تدوير الخلايا بالطرد المركزي وترسيبها، ثم التخلص من السائل الطافي.

بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في ستة ملي لترات من محلول التحلل المنظم الثاني (lysis buffer two)، ورُج الأنابيب بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. كرر عملية الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في 2.5 ملي لتر من محلول التحلل المنظم الثالث (lysis buffer three). بعد ذلك، جهز المعلق لعملية التجزئة بالموجات فوق الصوتية (sonication) عن طريق وضعه في كؤوس من الماء المثلج مع ضبط الطرف الدقيق لجهاز Branson 450 sonier على سعة تتراوح بين 50 و 60%.

قم بمعالجة المحلول بالموجات فوق الصوتية (Sonicate) بدفعات ثابتة مدة كل منها 32 جزءاً من الثانية، مع التبريد على الثلج. كرر هذه الدفعات من 10 إلى 15 مرة على مدار دقيقة واحدة، ثم اسحب محتويات الأنبوب وانفثها باستخدام الماصة (pipette) وانقلها إلى أنبوب جديد. استمر في تكرار عملية النبض والتبريد للمحلول.

بعد عملية السونكة بخمس مرات إضافية، أضف 10% Triton X 100 بمقدار يعادل عُشر حجم المحلول. ثم انقل المستخلصات إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter، وقم بإزالة الحطام عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي دقيق قبل إجراء عملية الترسيب المناعي للكروماتين أو chip. احتفظ بـ 50 microliters من مستخلص الخلايا كعينة مدخلات (input sample).

بعد ذلك، يتم دمج مستخلص الخلايا المصفى مع حبيبات dyna beads المرتبطة بالأجسام المضادة والتي تم تحضيرها مسبقاً كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. يتم تحريك الخليط، بالإضافة إلى عينة الإدخال بحجم 50 µL، على جهاز هزاز عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. تُغسل الحبيبات باستخدام 1 mL من محلول الغسيل.

بعد ذلك، استخدم حاملاً مغناطيسياً لجمع الحبيبات وإزالة الطافي. كرر عملية الغسل هذه من ست إلى ثماني مرات. قم بإجراء غسلة نهائية باستخدام 1 mL من محلول TE مضافاً إليه 50 millimolar من كلوريد الصوديوم.

قم بدوران الخرزات في جهاز طرد مركزي دقيق بعد عملية الطرد المركزي، ثم اسحب أي بقايا من منظم TE. بعد ذلك، أضف 100 µL من منظم الاستخلاص (elu buffer) إلى العينات فوراً.

يتم تحضين العينات عند 65 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. تُحك الأنابيب مقابل حامل أنابيب سعة 1.5 mL كل دقيقتين للحفاظ على الخرزات معلقة. تُجمع الخرزات باستخدام الطرد المركزي والحامل المغناطيسي، ثم يُنقل الـ SNAT إلى أنبوب PCR.

بعد ذلك، استعد عينة المدخلات (input sample) التي تم حفظها مسبقاً وأضف ثلاثة أحجام من محلول استخلاص (elution buffer). وأخيراً، ضع عينات الترسيب المناعي (IP) وعينات المدخلات في جهاز التدوير الحراري طوال الليل عند 65 °C. ولعكس الروابط المتصالبة في اليوم التالي، أضف حجماً واحداً من محلول TE buffer إلى العينات.

بعد ذلك، يتم إضافة RNAs A حتى يصل التركيز النهائي إلى 0.2 micrograms per microliter. تُحضن العينات في جهاز التدوير الحراري لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. وبعد انتهاء فترة التحضين، يُضاف proteinase K حتى يصل التركيز النهائي إلى 0.2 micrograms per microliter.

ثم يتم تحضين العينات في الجهاز الدوري الحراري عند 55 °C لمدة ساعتين. بعد ذلك، تُستخلص العينات مرة واحدة باستخدام حجم واحد من الفينول. وتُستخلص العينات مرة ثانية باستخدام حجم واحد من خليط الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل.

أخيراً، يتم استخلاص العينات مرة أخرى باستخدام حجم واحد من الكلوروفورم وكحول الأيزواميل. ثم يُضاف 30 micrograms من الجليكوجين إلى كل عينة. كما يُضاف كلوريد الصوديوم ليصل التركيز النهائي إلى 0.2 molar، ويُضاف حجمان من الإيثانول إلى العينات.

حضّنها لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -80 °C. بعد الحضن، قم بطرد العينات مركزياً وتخلص من السائل الطافي. اغسل الرواسب باستخدام 500 µL من ethanol بتركيز 75%، ثم جفف الرواسب وأعد تعليقها في 40 µL من الماء.

للتحقق من أحجام قطع DNA الناتجة عن عملية الـ SONICATION، قم بتحميل 5 µg من عينة المدخلات المنقاة في هلام أغاروز بتركيز 1.8% وقم بتشغيل الهلام. يجب أن تنتج عملية الـ sonication قطعاً تتراوح أحجامها ما بين 150 إلى 350 زوجاً قاعدياً. ومع ذلك، إذا لم تكن القطع ضمن هذا النطاق، فيجب تعديل عملية الـ sonication عن طريق تغيير عدد النبضات والسعة قبل تضخيم DNA الجينومي.

تحقق من حجم العينات وتركيزها ومدى إثرائها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لبدء تضخيم DNA الجينومي، احصل على 34 microliters من عينة IP و 200 nanograms من عينة input. قم بإجراء عملية إضافة الذيل (tail addition) وإصلاحها، ثم ربط المهايئات (adapters) بقطع DNA باستخدام طقم تحضير عينات DNA الجينومي من Illumina كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

قم بتنقية الـ DNA باستخدام طقم تنقية PCR مصغر، ثم استخلصه في منظم EB الذي تم تسخينه مسبقاً إلى 50 °C. استخدم 23 µL و46 µL لعينات الـ IP والـ input DNA على التوالي. قم بإجراء تفاعل PCR باستخدام 23 µL من الـ DNA مع المهايئات (adapters) و25 µL من DNA polymerase من الطقم.

أضف 1 µL من 20 µM من sole PCR one و 1 µL من 20 µM من So PCR two. أجْرِ تفاعل PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، وبعد تضخيم PCR، قم بتنقية الـ DNA باستخدام مجموعة Qiagen mini loop PCR purification kit.

قم بتدفئة 15 µL من المنظم EB مسبقاً إلى 50 °C وقم بتخفيف الحمض النووي DNA بنسبة 1 إلى 4 عن طريق تخفيف 0.5 µL من العينة، ثم أجرِ قراءة بجهاز NanoDrop لتنقية النواتج المضخمة. قم بتحضير هلام AGROS بتركيز 1.8% وحجم 50 mL باستخدام مياه من درجة HPLC، ثم أضف TAE والبروميد بعد انصهار agros. بعد ذلك، قم بصب الهلام، ثم قم بتحميل العينات عليه.

بعد إضافة أربعة µL من منظم التحميل (loading buffer) إلى عينات المدخلات (input) والترسيب المناعي (IP)، يتم تشغيل الهلام بجهد 120 فولت لمدة 45 دقيقة. يتم تحليل الهلام بعد انتهاء التشغيل، ومن المفترض أن تظهر النتائج إنتاج شظايا يتراوح طولها بين 150 و350 زوجاً قاعدياً (base pairs).

تمثل هذه القطع شظايا من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) يتراوح طولها بين 50 و250 زوجاً قاعدياً. ويتم استئصال المنطقة من الهلام التي تحتوي على المادة في نطاق 150 إلى 350 زوجاً قاعدياً باستخدام مشرط. يجب الحرص على تجنب استئصال حزمة المهايئ، والتي تظهر عند حوالي 120 زوجاً قاعدياً.

استخلص الحمض النووي DNA باستخدام طقم استخلاص سريع من الهلام (kayak quick gel extraction kit) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. جفف العينة حتى تصل بدقة إلى 11 µL في جهاز SpeedVac بدون استخدام الحرارة. اسحب 1 µL من العينة وقم بقياس تركيز DNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop.

أخيراً، قم بتحديد نواتج الجينات المثرية باستخدام محلل الجينوم Illumina وقم بتحليل مواقع الارتباط والجينات المستهدفة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تُعرض الإحداثيات الجينومية لمناطق ارتباط البروتين RBP two أو البروتين الرابط RB المثرية التي تم تحديدها بتنسيق مقسم حسب الكروموسومات. ويمكن تصور إشغالات جينات ensemble في الكروموسومات على شكل VARs سوداء.

تظهر هنا مستويات إشغال الكروموسوم 10، حيث تم تمثيل مناطق ارتباط rbp two كخطوط رأسية. يوضح اللوح الأوسط جميع مناطق ارتباط نظائر rbp two على الكروموسوم 10، بينما يوضح اللوح السفلي مناطق ارتباط النظير الكبير لـ rbp two. توفر هذه المعلومات نظرة عامة على الإشغال المتداخل والنوعي لنظائر RBP two على الكروموسوم 10.

يظهر هنا مخطط حراري للفئات الوظيفية الجزيئية في علم الوجود الجيني (GO) التي تم إثراؤها بشكل ملحوظ، والمصححة وفقاً لمعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR)، من بين الجينات المرتبطة بـ rbp. يشير اللونان المائلان إلى الأحمر إلى دلالة إحصائية عالية، بينما يشير اللون الأصفر إلى دلالة إحصائية منخفضة، ويشير اللون الرمادي إلى عدم وجود دلالة إحصائية.

يُظهر تحليل الإثراء الوظائف الجزيئية المتداخلة والمحددة للأشكال الإسوية لـ جيني هدف R BP two. لقد أظهرنا لك للتو كيفية تحديد مواقع ارتباط عامل النسخ خلال هذا الإجراء. ومن المهم إنتاج قطع DNA بنطاق الحجم والكمية المناسبين.

يمكن تحقيق ذلك من خلال اتباع إرشاداتنا أثناء خطوة الـ SONICATION. هذا كل شيء. بالتوفيق في تجاربكم، وشكراً للمشاهدة.