رواية النظرية الافتراضية تغيير نقطة حسابي لتحليل الجينوم-اسعة من أنواع البيانات المتنوعة ChIPseq

الهدف العام من التجربة التالية هو الاستفادة من كثافة مواقع القراءات المخططة من بيانات تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين لتقدير متوسط كثافة القراءات البعدية عبر الجينوم. ويتم تحقيق ذلك من خلال المعالجة المسبقة لقراءات ChIP-seq المخططة إلى ملفات تعريف كثافة كتلية، حيث يقع نفس العدد من القراءات ضمن صناديق غير متداخلة بحجم 200 زوج قاعدي.

يتم دمج أي حاويات متجاورة لها نفس الكثافة في كتلة أكبر، و كخطوة ثانية، يتم حساب متوسطات الكثافة البعدية لكل كتلة بشكل تكراري ضمن سياق جميع الكتل المحيطة باستخدام نموذج بايزي (Bayesian model) مع مرشحات أمامية وخلفية. حيث يتم نمذجة عدد القراءات لكل كتلة باستخدام توزيع بواسون (Poisson distribution) مع معامل theta الذي يتخذ توزيعاً سابقاً غاما (gamma prior distribution) بمعاملات alpha و beta. بعد ذلك، يتم تقييم تقديرات متوسط الكثافة البعدية لكل كتلة من حيث الدلالة بناءً على ما إذا كانت تتجاوز الكمي 90 (90th quantile) بالنسبة لكثافة خلفية التحكم المدخلة، وذلك من أجل توليد نتائج قطاعات الجينوم المثرية النهائية؛ وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها التسلسل بدءاً من القراءات المتسلسلة الخام، وصولاً إلى تقديرات متوسط كثافة القراءات البعدية، وأخيراً الجزر المثرية في بيانات ChIP-seq أثناء تحليل BCP.

علاوة على ذلك، تُظهر النتائج أن BCP يتفوق على الأداة المنافسة cer. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل CER في أن BCP استخدم أحدث التطورات في نماذج العلامات المخفية، مما يجعله أكثر قدرة على توصيف الفروق الدقيقة في تحليل بيانات chipsy مقارنة بالطرق الاستكشافية السابقة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم فوق الجينوم، مثل دور تعديلات histo من خلال توصيف أنماط إثراء هذه التعديلات على نطاق الجينوم بالكامل.

على الرغم من أن هذه الطريقة المطبقة على المريض يمكن أن توفر رؤية متعمقة في تحليل بيانات ChIP-seq، إلا أنه يمكن تطبيق الإطار الأساسي أيضًا على تحليلات بيانات تسلسل الجيل التالي الأخرى، مثل تحديد المناطق ذات الميثيل المتفاوت في بيانات تسلسل bis Sufi، أو مواقع النسخ الجديدة في RNA-Seq، أو تباين عدد النسخ، أو أي عدد من بيانات مصفوفات الدقيقة المقطعية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية للفهم الواضح للمنهجية ومزاياها، بينما تظل المزايا النظرية كامنة داخل البرمجيات.

لقد تم تجميع كافة الخطوات الإجرائية الموضحة هنا في ملف تنفيذي واحد ضمن حزمة برمجيات BCP، والتي تتوفر للتنزيل في هذا الفيديو. وتوصف الخطوات التي ينفذها البرنامج لتشغيل البرمجية. يتطلب الأمر ثلاثة معلمات.

ملف يحتوي على قراءات تم تعيينها بشكل فريد من عينة ChIP وملف مماثل لقراءات التحكم في المدخلات، بالإضافة إلى اسم ملف مخرجات لتجهيز ملفات المدخلات لتحليل BCP. أولاً، قم بمحاذاة القراءات القصيرة الناتجة عن عمليات التسلسل مع الجينوم المرجعي المناسب باستخدام برنامج محاذاة القراءات القصيرة المفضل. يجب تحويل المواقع التي تم تعيينها إلى تنسيق بيانات المتصفح القابلة للتوسيع (BED) المكون من ستة أعمدة، حيث يكون كل سطر مفصولاً بعلامة جدولة لكل قراءة تم تعيينها، موضحاً موضع بداية الكروموسوم المعين، وموضع النهاية، واسم القراءة، والدرجة، والشريط.

قم بتمديد مواقع خريطة الإدخال والرقاقة إلى طول قطعة محدد مسبقاً. على سبيل المثال، حجم القطعة المستهدف أثناء الهضم الإنزيمي أو استخدام الموجات فوق الصوتية للحمض النووي DNA، والذي يكون عادةً حوالي 200 base pairs. ثم يتم تجميع أعداد القطع في صناديق متجاورة.

افتراضياً، يتم ضبط حجم الصندوق (bin size) على طول القطعة المقدر بـ 200 base pairs. ومن المرجح أن تقع أي نقاط تغيير محتملة في مجموعة من الصناديق ذات أعداد القراءات المتطابقة عند الحدود الخارجية. وبناءً على ذلك، فمن غير المرجح أن تحدث نقطة تغيير عند حد داخلي بين صندوقين لهما نفس أعداد القراءات.

وبناءً على ذلك، يتم تجميع الصناديق المتجاورة التي تحتوي على عدد متطابق من القراءات لكل صندوق في كتلة واحدة. بعد تحضير ملفات الإدخال، يتم استدعاء تقدير BCP ببساطة عن طريق كتابة الأمر الموضح في أسفل الشاشة. وتتم نمذجة كثافة القراءة لكل كتلة على أنها توزيع بواسون بمعلمة متوسط theta تتبع خليطاً من توزيعات غاما بمعلمات alpha وbeta، مع احتمالية مسبقة لحدوث نقطة تغيير في أي كتلة.

إن تحديد حدود P عند تهيئة كل كتلة بهذه الطريقة يؤدي فعلياً إلى تكوين نموذج ماركوف الخفي (HMM) ذي حالة غير محدودة. يتم تقدير المعلمات الفائقة alpha وbeta وP باستخدام أقصى احتمال خلفي. يتم حساب تقديرات Bayes صراحةً لكل كتلة theta sub T بصفتها القيمة المتوقعة لـ theta sub T بمعلومية why sub T. وقد استُبدلت المرشحات الأمامية والخلفية التقليدية التي تستغرق وقتاً طويلاً وتُستخدم غالباً في HMS بتقدير تقريبي للمزيج ذو التعقيد المحدود والأكثر كفاءة حسابياً لتقدير المتوسطات الخلفية theta hat sub T. سيتم تنعيم المتوسطات الخلفية الناتجة لتصبح ملفاً تعريفياً تقريبياً ثابتاً على قطع، لذا يجب تجميع الكتل ذات theta hat sub T المتطابقة معاً بشكل إضافي مع تحديث إحداثيات الحدود.

يستخدم BCP عدد القراءات المدخلة لكل كتلة كمعدل خلفية ويحدد مدى الإثراء. ويتم ذلك باستخدام اختبار فرضية بسيط يعتمد على ما إذا كانت متوسط الكثافة في موضع الشريحة لكتلة ما يتجاوز عتبة دلالة معينة. ويُعد الشريكة التسعين (90th quantile) هي العتبة الافتراضية والمناسبة في معظم الحالات.

بعد ذلك، يقوم BCP بدمج كتل الكثافة المتوسطة الخلفية المتجاورة التي تتجاوز مستوى الإثراء في منطقة واحدة، ويقوم بإظهار الإحداثيات المدمجة في المتصفح. يتفوق تنسيق البيانات القابل للتوسيع BCP في تحديد مناطق الإثراء الواسعة في بيانات تعديل الهيستون. هنا، يتم مقارنة نتائج BCP مع نتائج cser، وهي أداة موجودة أثبتت أداءً قويًا؛ حيث أظهر عمل سابق لهذا المختبر في دراسة H3K36 trimethylation ميلًا لأن يكون حجم الجزر في BCP أكبر بكثير منه في cer.

تتماشى الجزر الأكبر حجماً بشكل أكبر مع التوقعات التقليدية للجزر المنتشرة والواسعة من إثراء H3K36 trimethylation. ولا يشير وجود جزر أكبر بمفرده إلى الدقة. لذلك، استُخدم الارتباط المعروف لجزر H3K36 Trimethylation مع أجسام الجينات المنسوخة بنشاط، بالإضافة إلى تعارضها المتبادل مع جزر H3K27 Trimethylation، لتقييم أداء BCP و CER مقارنة بـ CER؛ حيث حدد BCP جزرًا متصلة أكبر تضبط أجسام الجينات بشكل أفضل دون التضحية بزيادة التداخل مع جزر H3K27 trimethylation.

يحافظ برنامج BCP على تداخل عالٍ للجينات النشطة بواسطة جزر H3K36 trimethylation مع حدود محاذية بدقة لأجسام الجينات، دون زيادة درجة التداخل الإيجابي الكاذب مع جينات الفراغات بين الجينية ذات النسخ المكبوتة أو علامة الكبت H3K27 trimethylation. وعند تقييم قابلية تكرار تحديد جزر BCP في مجموعتي بيانات مكررتين، لوحظ أن BCP لم يعانِ من اعتماد شديد على عمق تغطية القراءة كما هو الحال في الخوارزمية المنافسة cser. كما تم تقديم أدلة إضافية على متانة BCP وقابلية تكراره من خلال فحص مناطق متميزة إضافية، مما أظهر حدود جزر متسقة رغم انخفاض عمق التغطية. ولإثبات تعدد استخدامات BCP بشكل كامل، تم الحصول على طيف واسع من بيانات تعديل الهيستون، بما في ذلك العلامات النقطية H3K27 acetylation وH3K9 acetylation وH3K4 trimethylation، والعلامة المنتشرة H3K9 trimethylation، بالإضافة إلى H3K27 trimethylation وH3K36 trimethylation. وقد تم تحليل مجموعات البيانات هذه باستخدام إعدادات المعلمات الافتراضية لكل من BCP وcser.

يوجد في المركز إثراء لعملية H3K36 trimethylation عند جين PXDN، مما يشير إلى عملية نسخ نشطة، والتي تنخفض بشكل متوقع عند موقع بدء النسخ؛ وتوجد علامات نشطة نقطية إضافية وهي H3K27 acetylation وH3K9 acetylation وH3K4 trimethylation. يقع مباشرة بعد PXDN مساحة بين جينية مثبطة تتميز بإثراء H3K27 trimethylation، بينما يوجد في الجانب المقابل جين مثبط بواسطة H3K27 trimethylation. وبالانتقال خطوة إضافية إلى الخارج.

يظهر لدينا كروماتين صامت كما يتضح من إثراء ثلاثي ميثيل H3K9، وهو ما يشير على الأرجح إلى إسكات SN TG2 و MYT1L، ربما بشكل أقل عابراً من الكبح بواسطة ثلاثي ميثيل H3K27. وتضم هذه المنطقة غالبية الظواهر التي تمت مواجهتها في ChIPseek لتعديلات الهيستون. وهي توضح كيف يمكن للطبيعة الديناميكية لـ BCP تحديد كل من علامات الاستيلاتيُن النقطية وثلاثي ميثيل H3K4، وفي الوقت ذاته تمييز جزر متصلة كبيرة من كبح ثلاثي ميثيل H3K27 وثلاثي ميثيل H3K9، بالإضافة إلى النسخ النشط المرتبط بثلاثي ميثيل H3K36.

يمكن تنفيذ هذه الخوارزمية في غضون 30 دقيقة تقريبًا، وذلك اعتمادًا على عدد القراءات ونتائج علامات الجينوم. ولا يتطلب هذا الإجراء أي تحسينات جوهرية كما هو الحال غالبًا مع الطرق الأخرى. ويمكن دراسة العديد من البروتينات المستهدفة المختلفة للترسيب المناعي للكروماتين باستخدام BBCP، بما في ذلك تعديلات الهيستون المختلفة الأخرى بالإضافة إلى عوامل نسخ الارتباط بالحمض النووي DNA للإجابة على أسئلة إضافية حول الآليات فوق الجينية وتنظيم الجينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام BCP لتحديد المناطق التي يمكن الوصول إليها لعلامات الهيستون المنتشرة في تحليل بيانات ChIP-seq.