تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

تبدأ تجربتنا البصرية عندما تمتص الصبغة البصرية في المستقبلات الضوئية الشبكية فوتونات الطاقة الضوئية، مما يؤدي في النهاية إلى إغلاق القنوات المبوبة للنيوكليوتيدات الحلقية في الغشاء الخلوي. ويؤدي ذلك إلى تثبيط إطلاق الناقل العصبي glutamate من كل من العصي والمخاريط. وتستشعر الخلايا الشبكية اللاحقة الـ glutamate المنطلق لدراسة الإشارات اللاحقة.

يتم استئصال العينين من فأر تم القتل الرحيم له. يتم عزل S، وتثبيتها في كتلة أغار، ثم تقطيعها باستخدام ميكروتوم اهتزازي. بعد ذلك، توضع شرائح الشبكية تحت المجهر ويتم تحفيزها باستخدام إضاءة LED.

يتم إجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) لقياس التيارات أو الجهود التشابكية المتولدة. وبشكل عام، يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب التعقيدات الإضافية الناجمة عن العمل في الظلام؛ لذا فإن القدرة على تصور العملية بأكملها ستمنحهم إدراكاً حسياً يصعب وصفه بطريقة أخرى.

ابدأ هذا الإجراء بطلاء أقطاب أسلاك التسجيل والمرجع التي سيتم استخدامها بطبقة من كلوريد الفضة. اغمس الأقطاب في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 1 molar. ثم باستخدام مصدر طاقة بقوة 15 volt وموجة جيبية بتردد 1 hertz، مرر جهدًا قدره 15 volts بينهما لمدة 20 ثانية تقريبًا.

باستخدام جهاز سحب الماصات الدقيقة، قم بتجهيز ماصات الرقعة (patch pipettes) من زجاج السيليكا BO المصقول بالنار، مع اختيار مقاومة طرف الماصة بناءً على حجم الخلايا المستهدفة؛ فبالنسبة لأجسام الخلايا التي يبلغ قطرها حوالي 20 ميكرون، استخدم ماصة PET بمقاومة طرف تتراوح بين 5 إلى 10 mega ohms. أما بالنسبة لأجسام الخلايا التي يقل قطرها عن خمسة ميكرونات، فاستخدم مقاومة طرف تتراوح بين 12 إلى 15 mega ohms.

لتحضير أقطاب المرجع الأرضية، استخدم محقنة لملء أنابيب البولي إيثيلين بمحلول agar بتركيز 3.5% مُحضّر في كلوريد الصوديوم بتركيز 1 millimolar. بعد ذلك، قم بتحضير المحاليل التالية وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق: محلول الحمام الخارجي، ومحلول التقطيع، والمحلول الداخلي لماصة Aspartate potassium، وسدادة agar الخلفية.

تُحفظ جميع المحاليل عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت استخدامها. في يوم التجربة، يُسكب حوالي 1.5 mL من محلول البوتاسيوم أسبارتات الداخلي، ثم يُضاف الـ Fluor المخفف.

صب حوالي 50 milliliters من وسط aims الذي يحتوي على بيكربونات الصوديوم في حاوية تخزين محكمة الإغلاق ومعتمة للضوء. قم بتوصيل الأنبوب البلاستيكي بخزان غاز يحتوي على 5% carbon dioxide و95% oxygen لموازنة وسط aims مع الغاز، ثم ضع الحاوية في حمام مائي تتراوح درجة حرارته بين 30 to 32 degrees Celsius. بعد ذلك، املأ زجاجة بـ 110 milliliters من وسط aims الذي يحتوي على he peas وضعه على الثلج.

قم بموازنة الوسط عن طريق تمرير غاز oxygen بنسبة 100% في المحلول. ضع ما تبقى من وسط aimes الذي يحتوي على بيكربونات الصوديوم في خزان مسخن فوق قفص فاراداي. لف ورق البارافورم حول الأنابيب وفتحة الزجاجة لحبس الغاز في المساحة الموجودة فوق المحلول والموازنة مع 5% carbon dioxide و 95% oxygen gas.

باستخدام أنبوب تشتيت هوائي زجاجي، قم بتحضير agar بنسبة 3% ومنخفض درجة حرارة الهلام عن طريق إضافة 0.75 grams إلى 25 milliliters من وسط aims مع التسخين. يتم تسخين المحلول إلى حوالي 115 درجة Celsius مع التقليب. وعندما يصبح المحلول رائقاً وخالياً من الفقاعات، ضع محلول agar المصهور في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة Celsius.

قم بتجهيز غرفة التسجيل على المجهر المقلوب. مرر جسراً من الآجار بطول خمسة سنتيمتر فوق قطب المرجع الفضي/كلوريد الفضة وثبته في غرفة التسجيل. يمكن قياس مقاومة طرف الماصة عن طريق ملء الماصة بالمحلول الداخلي، ووضعها على حامل الماصة، ثم وضع حامل الماصة في مرحلة رأس المضخم، وخفض الماصة داخل المحلول. وللحفاظ على الصبغة البصرية من أجل التسجيلات الفسيولوجية، يجب تنفيذ جميع الإجراءات تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء باستخدام نظارات الأشعة تحت الحمراء، ولكن سيتم عرض جميع الإجراءات هنا في ضوء الغرفة.

بعد القتل الرحيم للفأر، استخدم مقصاً منحنيًا لإزالة العينين بسرعة. ضع العينين على قطعة من ورق الترشيح لمنعهما من التدحرج. بعد ذلك، ثبت إحدى العينين باستخدام ملقط واستخدم شفرة رفيعة مزدوجة الجوانب لإحداث شق في القرنية.

بمجرد ثقب مقلة العين، يتم نقل العين إلى طبق بتري بقطر 60 ملليمتر مملوء بوسط aims. وباستخدام الشق الموجود في القرنية كنقطة دخول، تُستخدم مقصات صغيرة لقص الأجزاء المتبقية من القرنية.

بعد ذلك، قم بإزالة العدسة والجسم الزجاجي، مع التأكد من بقاء الشبكية متصلة بكأس العين. ضعها في حاوية معتمة مملوءة بوسط aims، المتوازن مع 5% carbon dioxide في 95% oxygen عند 32 degrees celsius.

بعد ذلك، قم بقطع نصف القسم العيني. قم بإزالة إحدى كؤوس العين باستخدام شفرة مشرط رقم 10. افصل الشبكية عن الظهارة الصبغية للشبكية.

قم بإزالة حواف الشبكية للسماح للنسيج بالاستقرار بشكل مسطح. استخدم ماصة زجاجية صغيرة بكرة مطاطية لملء طبق بتري بقطر 35 مليمتر بآجار ذو درجة حرارة تجمد منخفضة مصهور، ثم مرر الملقط عبر الآجار لاختبار قوامه. وبمجرد أن يبدأ الآجار في التصلب، انقل الشبكية إلى سطح الآجار.

بعد ذلك، ودون لمس الشبكية، استخدم قطعة ملتوية من مناديل Kim wipe لامتصاص المحلول الزائد من حولها. ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات إضافية من الآجار مباشرة على الشبكية، ثم ضع بسرعة أسطوانة بلاستيكية لتشكيل جدار حولها مع الحفاظ على الشبكية بالقرب من مركز الأسطوانة، ثم أضف المزيد من الآجار المصهور بالتنقيط، وانقل طبق بتري إلى حمام مائي مثلج للتبريد. بعد 30 ثانية، قم بإزالة النسيج واستخدم مكبساً لإخراج كتلة الآجار، مع الدفع من الجانب الأبعد عن الشبكية.

استخدم شفرة حلاقة أحادية الجانب لقص قطعة صغيرة من الآجار تحتوي على الشبكية، ثم ثبت القطعة باستخدام الغراء الفائق (super glue) مقابل مسند الآجار الخلفي الموجود على قرص العينة. انقل قرص العينة إلى حامل الميكروتوم الاهتزازي وصب محلول aims heaps المبرد بالثلج في الحامل، مع التأكد من غمر القطعة التي تحتوي على الشبكية بالكامل. قم بقطع شرائح من الشبكية بسمك يبلغ حوالي 200 ميكرون باستخدام أقصى معدل اهتزاز للشفرة، مع ضبط سرعة تقدم الشفرة بحيث يستغرق القطع عبر الشبكية من أربع إلى خمس ثوانٍ لمرة واحدة.

استخدم شفرة مشرط رقم 11 لقطع كل شريحة صالحة للاستخدام من الكتلة واحدة تلو الأخرى. ضع الشرائح التي تحتوي على الشبكية في غرف التسجيل وثبتها في مكانها. وباستخدام مثبتات الشرائح، مرر خيوط النايلون عبر مثبت الشريحة.

قم بتثبيت الآجار المحيط بالشبكية، مع ترك الشبكية دون عوائق. ولإجراء التسجيلات، انقل غرفة التسجيل إلى منصة المجهر الرأسي.

أغلق الستارة وقم بتشغيل مصدر الضوء تحت الأحمر لعرض الشريحة عبر كاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء. حدد تحت المجهر شريحة شبكية ذات مستقبلات ضوئية سليمة وبزاوية قطع مناسبة. قد يظهر بعض الضرر السطحي نتيجة لعملية التقطيع.

باستخدام ماصة ذات طرف مكسور، قم بسحب أجسام الخلايا الميتة برفق. ولإزالة هذه الطبقة الرقيقة من الخلايا، وبمجرد ظهور طبقة سليمة من الخلايا الحية، حدد جسم خلية يقع في الطبقات المستهدفة. حرك طرف الماصة بحيث يسبب انبعاجاً في غشاء الخلية، ثم طبق ضغطاً سلبياً أو داخلياً خفيفاً لإنشاء سدادة عالية المقاومة. يمكن تحقيق وضع الخلية الكاملة من خلال تطبيق ضغط سلبي على القطب الكهربائي لاختراق الخلية.

بعد ذلك، قم بتحفيز أنسجة الشبكية بالضوء باستخدام صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) لاستثارة الاستجابات. في نهاية التسجيل، التقط صورة باستخدام ضوء الإثارة المناسب للمادة الفلورية التي انتقلت إلى الخلية عن طريق الديلزة من المحلول الداخلي للماصة. يظهر هنا جهود الاستثارة الضوئية لعصبون شبكي متكيف مع الظلام تجاه ومضات ضوئية ذات شدة متزايدة.

هذا الشكل عبارة عن صورة فلورية مأخوذة من شريحة شبكية حيث تم ملء الخلايا بصبغة Lucifer yellow الفلورية، ويظهر الفلور المستحث شكل الخلايا التي أُجريت منها تسجيلات الرقعة (patch recordings). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لبعض التعقيدات المتعلقة بإجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) من شرائح شبكية متكيفة مع الظلام. الهدف من هذا الإجراء هو قياس الاستجابات المستحثة بالضوء تحت إضاءة محكومة.

وللقيام بذلك، يتعين علينا أولاً عزل الشبكية، وتضمينها في مادة الأجار (agar)، ثم تحضير شرائح شبكية يمكننا من خلالها إجراء تسجيلات للخلايا المفردة.