التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم ^{2 +} التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح شبكية مغمورة في الآجار لدراسة الدوائر الدقيقة الموجودة في النهايات العصبية للخلايا ثنائية القطب قبل التشابكية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الحصول على الشبكية من عين سمكة ذهبية متكيفة مع الظلام، وقص قطعة مستطيلة صغيرة من هذه الشبكية. ثم تُغمر قطعة الشبكية في محلول آجار شفاف ومنخفض درجة الانصهار، والذي يتم تجميده بعد ذلك في محلول تقطيع بارد ومناسب.

تتمثل الخطوة التالية في تقطيع كتلة الآجار الصلبة التي تحتوي على قطعة مستطيلة من الشبكية باستخدام جهاز الهزاز (vibrator). أما الخطوة النهائية فهي التصوير والتعرف ثم تثبيت طرف عصبي لخلية ثنائية القطب.

وفي نهاية المطاف، تُظهر النتائج تيار الكالسيوم قبل التشابكي والإخراج الخلوي الفيزيائي التشابكي من خلال قياسات سعة الغشاء لنهايات الخلايا ثنائية القطب المذررة والسليمة. مرحباً، اسمي هان كيم. أنا باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر PCO في معهد Burham.

سأقوم اليوم بتقديم طريقة تحضير شرائح الشبكية الوجهية الباردة المدمجة بتقنية AGA، وسأوضح قياس سعة التثبيت باستخدام تقنية "patch clamp" في أنبوب واحد. لبدء هذا الإجراء، يتم تقسيم كل عين من عيون السمكة الذهبية عن طريق القص بالتساوي حول مقدمة العين باستخدام مقص زنبركي. بعد ذلك، توضع أكواب العين في محلول شرائح مبرد خالٍ من الكالسيوم.

إذا لزم الأمر، قم بإزالة العدسة باستخدام الملاقط. بعد ذلك، قم بإزالة الظهارة الصبغية الملتصقة بالشبكية عن طريق تقشير الشبكية بعيداً عن كأس العين باستخدام ملقط دقيق ذو طرف مائل بزاوية 45 درجة. بعد ذلك، اقطع العصب البصري إما باستخدام ملقط دقيق أو مقصات زنبركية.

ثم قم بالتطبيق بالشفط باستخدام ماصة باستور معدلة أو ماصة نقل ذات طرف كبير. ولإزالة الشبكية، قم بإزالة بقية الظهارة الصبغية الملتصقة بالشبكية برفق. يجب أن يظهر سطح الشبكية النظيفة والسليمة أملسًا.

بعد ذلك، تُعامل الشبكية المعزولة بـ IDE بتركيز 0.03% تقريباً لمدة تتراوح بين 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ولإزالة الجسم الزجاجي، يُراعى تنفيذ هذه العملية في إضاءة خافتة. وفي الخطوة التالية، تُقطع قطعة مستطيلة من الشبكية بمقاس 2×2 مليمتر تقريباً، بحيث تشمل كامل سمك الشبكية، وذلك عن طريق إزالة الحواف المنحنية باستخدام شفرة حلاقة.

ثم انقل قطعة الشبكية إلى حاوية صغيرة مملوءة بمحلول الآجار، وحاول تقليل كمية المحلول المحيط بالشبكية عند وضعها في الآجار السائل. بعد ذلك، اغمر الشبكية مع الآجار مباشرة في محلول الشرائح المبرد بالثلج من أجل تصلب الآجار. بعد ذلك، اقطع كتلة الآجار الصلبة التي تحتوي على قطعة الشبكية المستطيلة إلى مكعب بحجم 1×1×1 سنتيمتر.

قم بلصق الكتلة على سطح لوحة التقطيع في غرفة التقطيع المسبقة. ثم قم بتقطيع الكتلة إلى شرائح يتراوح سمكها بين 200 إلى 250 ميكرون في محلول التقطيع المبرد بالثلج. باستخدام جهاز vibratome، يمكن الحصول على ما مجموعه خمس إلى 10 شرائح، تظل قابلة للحياة لمدة تتراوح بين خمس إلى ست ساعات تقريباً.

بعد ذلك، انقل إحدى الشرائح إلى غرفة التسجيل. ضع إطاراً بلاتينياً على شكل حرف U يحتوي على شبكة من خيوط النايلون فوق الشريحة. قم بتروية الشريحة باستمرار بمعدل 1 إلى 2 مل لكل دقيقة باستخدام محلول التسجيل المشبع بالكربوجين.

في هذه الخطوة، استخدم حقنة ذات رأس مرشح بسعة 0.2 micron لملء ماصة الرقعة الزجاجية بالمحلول الداخلي حتى مستوى يرتفع سنتيمتراً واحداً إلى اثنين من الجزء الخلفي للماصة. بعد ذلك، قم بإزالة الفقاعات الهوائية من الرأس. ثم ثبت الماصة في الحامل.

قم بتطبيق ضغط إيجابي على الماصة وحركها باتجاه النهاية العصبية المستهدفة باستخدام الملاعب الدقيق (micro manipulator) مع تحريك الطرف إلى الأسفل عبر الشريحة. حرك الماصة في اتجاه مسح جانبي لضمان عدم سحب الشريحة مع الطرف. ثم حرك طرف الماصة حول النهاية العصبية لتنظيف سطح الغشاء.

ادفع الطرف لأسفل ضد حافة النهاية لإنشاء نقرة (dimple) ثم حرر الضغط الموجب. إذا لم يتكون ختم جيجا أوم (giga ohm seal) على الفور، فقم بتطبيق ضغط سلبي طفيف على الماصة. وبمجرد تكوين ختم جيجا أوم، قم بتحويل مضخم patch clamp من طراز E PC nine إلى وضع تسجيل onsell، وغير جهد الحفظ (holding potential) إلى -60 أو -70 millivolts.

قم بتطبيق تصحيح السعة السريع وانتظر حتى يستقر الختم بين 5 إلى 10 giga ohms. ثم قم بتمزيق الغشاء باستخدام شفط حاد ولطيف، وذلك لإنشاء تكوين تسجيل الخلية الكاملة.

يمكنك أيضاً استخدام الشفط الفموي بدلاً من المحقنة. بعد تثبيت تكوين الخلية الكاملة على طرف MB المذرر، قم بتطبيق إزالة استقطاب خطوية لمدة 200 millisecond من 70- إلى صفر millivolt. تذكر أنه يتم تطبيق موجة جيبية بتردد 2 kilohertz في وضع تثبيت الجهد قبل وبعد إزالة الاستقطاب هذه. ومن أجل قياس سعة الغشاء، تسمح عملية إزالة الاستقطاب بالقياس المباشر لتيارات الكالسيوم الداخلية التي يتم تنشيطها عن طريق فتح قنوات الكالسيوم من النوع L المعتمدة على الجهد مع استخدام محلول داخلي قائم على السيزيوم.

وبالتوازي مع ذلك، يمكن مراقبة القفزة في السعة الكهربائية الناتجة عن الإخراج الخلوي المعتمد على الكالسيوم للحويصلات التشابكية، مما يؤدي إلى زيادة مساحة سطح الغشاء. وإذا تم إجراء تثبيت غشائي لخلية ثنائية القطب سليمة من نوع MB باستخدام الماصة على الطرف التشابكي، فلن تُلاحظ تيارات كالسيوم متميزة بسبب تيارات التسريب الكبيرة الناتجة عن اقتران الوصلات الفجوية في الخلايا ثنائية القطب من نوع MB. وما يتم ملاحظته هو تيار كبير يشبه تيار التسريب الخارجي.

ومع ذلك، لا يزال من الممكن مراقبة قفزة السعة باستخدام تحفيز جيبي عالي التردد يتم تفعيله قبل وبعد خطوة إزالة الاستقطاب الموضحة. وفيما يلي أمثلة لـ I-R-D-I-C، وهي صور لنهايات الخلايا ثنائية القطب M. ومن المرجح أن تظهر النهايات السليمة بشكل بيضاوي كما هو موضح في A و B، بينما تظهر C النهاية المختلطة، والتي تبدو مستديرة ودائرية.

يمكن استخدام طريقة ملء الصبغة أيضاً لتصنيف النهايات الخلوية. إليكم أمثلة لصور الفلوريسنس لنهايات خلايا MBI ثنائية القطب مع محور عصبي سليم في D، ومحور عصبي مقطوع جزئياً في e، ومحور عصبي مستأصل بالكامل في F. وقد أشير إلى نهاياتها بواسطة الأسهم الزرقاء. يظهر هنا القياس المباشر لإشارات تصوير الكالسيوم للإفراز الخلوي والتغذية الراجعة المثبطة.

في طرف خلية ثنائية القطب في الجسم الفطري (MB)، تم تنشيط تركيز كالسيوم متزايد وعابر في تيليريا (teleria) طرف الجسم الفطري بواسطة خطوة إزالة استقطاب باستخدام مثبت الجهد، ويمكن رؤية الصورة الفلورية المقابلة لتيليريا الجسم الفطري في B. وتظهر في C أمثلة على الاكتئاب التشابكي قصير المدى لإفراز الناقل العصبي. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تقليل كمية المحلول حول الشبكية عند وضعها في أغار الطقم؛ حيث سيؤدي ذلك إلى تحسين التصاق الأنسجة بكتلة الأغار.