تصور الأعصاب القطاعي اليرقات في 3 ^{الثالثة} طور مرحلي ذبابة الفاكهة التحضيرات اليرقات

يمكن دراسة النقل المحوري من خلال تصوير الأعصاب القطعية اليرقية. يرقات الدروسوفيلا في الطور الثالث. يتم أولاً تشريح اليرقة للكشف عن الجهاز العصبي المركزي دون إتلاف الفصوص البصرية، والعقدة البطنية، والأعصاب القطعية.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تثبيت الحمم في الفورمالديهايد قبل التحضين مع الجسم المضاد الأولي طوال الليل والجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد ذلك، يتم تثبيت الحمم على شريحة زجاجية وفحص عيوب النقل المحوري. كما يمكن فحص تموضع البروتين وتوزيعه من خلال مجهر التألق المناعي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول النقل المحوري، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل مورفولوجيا المشبك العصبي والعضلات. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في البداية لأن إجراء هذا التشريح المسموح به يتطلب دقة، خاصة للحفاظ على سلامة الأعصاب القطعية في الدماغ والعضلات. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير محلول تثبيت منظم للتشريح بتركيز 1×، ومحلول PBT بتركيز 1×، ومحلول BSA بتركيز 5%.

كما هو مفصل في الجدول الموضح قبل عملية التشريح، قم بتجهيز زوج نظيف من ملاقط رقم 5، وزوج نظيف من مقصات التشريح ذات الشفرة المستقيمة ودبابيس لبدء التشريح، واستخدم ملعقة دقيقة لجمع يرقات instar الثالثة ذات نمط جيني محدد في أطباق بتري. بعد ذلك، اغسل اليرقات عن طريق شطفها في طبق بتري مليء بالماء منزوع الأيونات للتخلص من جميع بقايا الطعام.

بعد ذلك، ضع اليرقة على طبق حراسة S بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. قم بتثبيت اليرقة من طرفيها الأمامي والخلفي، ثم ضع قطرة من محلول التقطيع المؤقت على اليرقة المثبتة باستخدام مقص دقيق.

اقطع الجلد عند الخط الناصفي الظهري بالقرب من الطرف الخلفي. باستخدام المقص، استأصل كيوتيكل الجلد من الطرف الخلفي وصولاً إلى الطرف الأمامي. ضع قطرة من محلول التقطيع new one times dissection buffer على الجلد الذي تم تشريحه.

باستخدام دبوس، ارفع إحدى الحواف الجانبية للكيوتيكل بالقرب من منتصف اليرقة وثبّت الكيوتيكل باستخدام دبوس آخر. وبالنسبة للحافة الجانبية الثانية من الكيوتيكل، يتم استخدام دبوسين على كل جانب جانبي كما هو موضح في المخطط. الآن، قم بإزالة الأمعاء والأجسام الدهنية والقصبات الهوائية بعناية، مع الإبقاء فقط على الدماغ مع الفصين البصريين والعقد البطنية.

بعد تثبيت الأعصاب القطعية، يتم إجراء عملية التثبيت وصبغ الأجسام المضادة بينما اليرقات مثبتة في طبق الحماية. تُحضن اليرقات المُشرحة في 50 µL من المثبت لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت، يتم استبدال المثبت كل 15 دقيقة، ثم تُشطف اليرقات في PBT مرة واحدة لمدة 30 دقيقة.

عند استبدال المحلول المنظم كل 10 دقائق، من المهم ملاحظة أنه يجب أن تظل اليرقات مغمورة دائماً في المحلول المنظم. قم بتحضير محلول الجسم المضاد الأولي عن طريق تخفيفه للوصول إلى التركيز المناسب في محلول 5%BSA. تختلف التركيزات المثلى باختلاف الأجسام المضادة.

قم بإنشاء غرفة رطبة عن طريق تبطين طبق بلاستيكي بـ Kim. Wipe مبللة بالماء. استبدل الأخيرة مرة واحدة PBT.

اشطف باستخدام محلول الأجسام المضادة الأولية المُحضّر، ثم حضّن في غرفة رطبة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل حتى اليوم التالي. اشطف اليرقات المُشرحة في محلول PBT بتركيز 1x لمدة 30 دقيقة مع استبدال المحلول المنظم كل 10 دقائق. حضّر الأجسام المضادة الثانوية بتخفيفها إلى التركيز المناسب في محلول BSA بتركيز 5%.

قم بتغليف الغرفة الرطبة بورق القصدير لأن بعض الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء. يتم تحضين اليرقات مع محلول الجسم المضاد الثانوي عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة. عند انتهاء التحضين مع الجسم المضاد الثانوي، تُشطف اليرقات في محلول PBT لمرة واحدة لمدة 30 دقيقة مع استبدال المحلول المنظم كل 10 دقائق، ثم يتم الانتقال إلى تثبيت وتصور اليرقات المشرحة قبل وضع اليرقات على الشريحة.

قم بتجهيز الشريحة عن طريق وضع خطين رأسيين من طلاء الأظافر في المنتصف، مع ترك مسافة كافية لوضع غطاء الشريحة كما هو موضح في المخطط. اترك طلاء الأظافر ليجف تماماً. عندما يجف طلاء الأظافر، ضع قطرة من محلول التثبيت (mounting buffer) في المسافة الموجودة بين خطوط طلاء الأظافر الرأسية على الشريحة كما هو موضح في هذه الصورة.

أصبحت الشريحة الآن جاهزة للتثبيت. استخرج اليرقات بعد انتهاء آخر عملية PBT. اشطف اليرقة ثم قم بإزالة الدبابيس الجانبية منها برفق.

كن حذراً كي لا تمزق الجلد الخارجي (cuticle) بعناية. قم بإزالة الدبوسين المتبقيين والتقط اليرقة باستخدام الملقط وضعها على الشريحة المجهزة. تأكد من أن اليرقة لم تنقلب وأنها موجهة من الناحية البطنية.

ضع غطاء الشريحة بلطف بحيث يكون الجانب العلوي للأعلى، ثم أحكم إغلاق الحواف باستخدام طلاء الأظافر كما هو موضح هنا. أصبحت اليرقات الآن جاهزة للفحص تحت المجهر الفلوري. هذه الصورة التمثيلية ليرقة من النوع البري مصبوغة بأجسام مضادة ضد بروتين الحويصلات المشبكية، cystine string protein.

تظهر الأعصاب القطعية في lava مصبوغة بشكل متجانس. هنا، تم صبغ طفرة lava في البروتين الحركي باستخدام أجسام مضادة لـ CSP. وتظهر الأعصاب القطعية تراكمات هائلة تصطبغ بوضوح لـ CSP.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على الأعصاب القطعية المتصلة بالدماغ وإبقاء العضلات سليمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التشريح. قم بتثبيت صبغة مناعية ثالثة وابدأ في فحص الأعصاب القطعية اليرقية لدراسة النقل المحوري باستخدام مجهر فلوري.