التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أجنة oph وmelanogaster للتصوير الكامل للجهاز العصبي. ويتم تحقيق ذلك من خلال جمع الأجنة أولاً من سلالة الذبابة المطلوبة، ثم تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إزالة الغشاء الكوريومي باستخدام المبيض.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة heptane وmethanol لإزالة غشاء vilin. والخطوة النهائية من الإجراء هي إضافة الأجسام المضادة إلى الأجنة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر بنية الجهاز العصبي لجنين drosophila من خلال مجهر الفلورة المناعية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلوم العصبية، مثل الدور الذي يمكن أن تلعبه الطفرات في الجهاز العصبي النامي. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأنهم قد يقومون بسحب الأجنة من القارورة عن طريق الخطأ. ابدأ هذا البروتوكول بتحضير الكواشف التي ستكون مطلوبة، بما في ذلك P-E-M-F-A، ومحلول PBC 5%BSA المنظم مع 0.01%sodium azide الملحي، ومثبت الفورمالديهايد.

قم بتجهيز قفص لسلالة ذبابة الفاكهة (drosophila) المطلوبة عن طريق تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون، ثم انقل 100 ذبابة على الأقل إلى زجاجة بلاستيكية تحتوي على محول مثبت به طبق تغذية من آجار عصير التفاح. ضع قفص الذباب في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة. استبدل أطباق تغذية آجار عصير التفاح كل ثماني إلى 12 ساعة لضمان تأقلم الذباب مع القفص وعدم احتفاظها بالبيوض من أجل التجربة.

بعد فترة التأقلم التي تستمر 72 ساعة، يتم جمع الأجنة بعد مرور 12 ساعة من آخر تغيير لطبق تغذية آجار عصير التفاح. أخرج طبق تغذية آجار عصير التفاح من قفص الوضع واستبدله باستخدام محلول ملحي، ثم اشطف طبق تغذية آجار عصير التفاح.

اجمع الأجنة في مصفاة دقيقة. استخدم فرشاة طلاء نظيفة لإزاحة أي أجنة لا تزال عالقة بالصفيحة. اشطف الأجنة الموجودة في المصفاة بمحلول ملحي لإزالة أي خميرة زائدة، ثم استخدم ملعقة مختبرية لالتقاط الأجنة برفق ووضعها في قارورة زجاجية صغيرة.

أضف حوالي 1 milliliter من المحلول الملحي. ثم أغلق الأنبوب وأحكم إغلاقه واتركه في الحاضنة لمدة خمس دقائق لغسل الأجنة. يلي ذلك عملية جمع الأجنة.

قم بتحضير محلول التثبيت المكون من الهبتان عن طريق دمج 50% heptane و50% من المثبت. سيتكون المحلول من طبقتين، حيث يكون الهبتان في الأعلى والمثبت في الأسفل. بعد مرور خمس دقائق، استخدم ماصة باستا لإزالة المحلول الملحي الزائد من القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة.

اشطف الأجنة بالماء منزوع الأيونات عن طريق إضافة حوالي 1 mL من الماء منزوع الأيونات إلى القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة. اترك الأجنة لمدة دقيقة واحدة قبل إزالة الماء وإضافة محلول تبييض بتركيز 50%. رج القارورة يدوياً بضع مرات ثم قم بالتحضين لمدة ثلاث دقائق من أجل تغطية الأجنة.

ستغوص الأجنة الملقحة إلى قاع القارورة، بينما ستطفو الـ CORs الجنينية. قم بإزالة المبيض ومحلول التبييض والـ CORs بعد فترة تحضين مدتها ثلاث دقائق.

بعد عملية التزيين، اشطف الأجنة جيداً بالماء منزوع الأيونات عبر إضافة نحو 1 مل من الماء منزوع الأيونات إلى القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة. اترك الأجنة لمدة دقيقة واحدة قبل إزالة الماء؛ حيث ستطفو بقايا CORs ويجب إزالتها. أضف محلول تثبيت الهبتان إلى الأجنة واحضنها لمدة 30 دقيقة مع الرج اللطيف لتثبيتها، وذلك بعد إتمام عملية التثبيت.

استخدم ماصة باستور لإزالة المثبت، وهو الطبقة السفلية، مع ترك الهيبتان في الأنبوب. ثم أضف الميثانول مرة أخرى إلى قاع الأنبوب بدلاً من المثبت، وأغلق الأنبوب ورجه بقوة يدويًا لإزالة الغشاء المحيقي. بعد هذه الخطوة، ستغوص الأجنة إلى قاع الأنبوب.

باستخدام ماصة باستور، قم بإزالة الميثانول والرواسب من القارورة مع ترك الأجنة منزوعة الأيونات. بعد ذلك، اشطف الأجنة خمس مرات بالميثانول، مع إزالة الميثانول بواسطة ماصة باستور بين كل عملية شطف. وفي كل عملية شطف، يتم تحضين الأجنة لمدة خمس دقائق.

ضع الأجنة في خليط مكون من 50% من محلول PBT و50% ميثانول لمدة خمس دقائق لإعادة ترطيبها. ثم استكمل عملية إعادة الترطيب بنقلها إلى محلول PBT بنسبة 100% لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بحجب الأجنة عن طريق تحضينها في محلول BSA بنسبة 5% مع 0.01% من أزيد الصوديوم لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد ذلك، قم بتحضير الجسم المضاد الأولي لصبغ الأجنة عن طريق تخفيفه إلى التركيز المناسب باستخدام محلول 5%BSA مع 0.01%Sodium azide. الأجسام المضادة المستخدمة هنا موجهة ضد vesicular cysteine string protein والجسم المضاد anti HRP. يتعرف anti HRP على جزء كربوهيدراتي محدد عصبيًا موجود في البروتينات السكرية السطحية، مما يعمل على وسم جميع الخلايا العصبية.

يُحضن الأجنة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في محلول الأجسام المضادة الأولية. تُغسل الأجنة 10 مرات بمحلول PBT على مدار ساعة واحدة. وبإضافة حوالي 1 mL من محلول PBT إلى القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة، تُترك الأجنة لمدة ست دقائق قبل إزالة محلول PBT.

كرر هذه العملية من وضع PBT، والتحضين، وإزالة PBT عشر مرات. قم بتحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية في الظلام لأنها حساسة للضوء عن طريق التخفيف إلى التركيز المناسب. نحن نستخدم أجسام Alexa المضادة الثانوية بتركيز 1 إلى 200.

حضّن الأجنة لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C في محلول الجسم المضاد الثانوي. غلف القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة ومحلول الجسم المضاد الثانوي بورق ألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. اغسل الأجنة 10 مرات باستخدام PBT على مدار ساعة واحدة.

أضف وسط التثبيت vector shield إلى الأجنة واتركها تحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C لإتمام عملية التثبيت. استخدم ماصة باستير لسحب الأجنة مع جزء من وسط التثبيت، ثم ضع الأجنة والوسط على شريحة زجاجية.

ضع غطاءً زجاجياً فوق الأجنة وقم بسد حواف الغطاء باستخدام طلاء الأظافر. قم بفحص الأجنة باستخدام مجهر فلوري هنا. يظهر الجهاز العصبي المركزي الجنيني في المرحلة 16 إلى 17.

يظهر بروتين سلسلة السيستين باللون الأحمر. وتظهر عصبونات HRP باللون الأخضر. لاحظ الصبغ المميز للمقاطع العرضية في هذه الصورة التمثيلية.

يظهر الجهاز العصبي المحيطي (PNS) الجنيني في المرحلة 16 إلى 17. ومرة أخرى، يظهر بروتين خيط السيستين باللون الأحمر، وتظهر العصبونات باللون الأخضر. لاحظ الأنماط المتكررة للعصبونات المحيطية.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراعاة الأجنة لتجنب إخراجها من القارورة عن طريق الخطأ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أجنة oph fla للتصوير الكامل للجهاز العصبي.