غراميسيدين القائم على الفحص الإسفار ؛ لتحديد الجزيئات الصغيرة المحتملة لتعديل خصائص طبقة ثنائية الدهن

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات التي تحدثها الأدوية في خصائص الطبقة الثنائية كما تستشعرها البروتينات التي تمتد عبر هذه الطبقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير حويصلات صغيرة أحادية الجانب ومحملة بـ Fluor. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تشريب الحويصلات بـ gramin.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة مُخمِد خارجي وقياس معدل إخماد الفلورفور internal fluoro. رابعاً، تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تقدير التغير في إخماد الفلور لكل نشاط gramin عن طريق ملاءمة دالة أسية ممتدة مع المخطط الزمني للفلورة. وفي النهاية، يمكن الحصول على النتائج لتقييم ما إذا كانت amfi files قادرة على تغيير خصائص الطبقة الدهنية المزدوجة.

مرحباً، أنا أولا أندرسون. مرحباً، أنا هيلسون. أهلاً، أنا ريتشي كابو.

وأنا ليا سانفورد من مختبر الدكتور أولاف أندرسون في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في كلية ويل كورنيل الطبية. سنعرض لكم اليوم إجراءً لقياس التغيرات في خصائص الطبقة الدهنية الثنائية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات العقاقير والجزيئات الصغيرة على خصائص الطبقة الدهنية الثنائية.

لنبدأ الآن. في اليوم الأول من هذا الإجراء، أخرج الليبيد من المجمد واتركه حتى يتوازن مع درجة حرارة الغرفة. وبمجرد وصوله إلى حالة التوازن، أضف 0.6 milliliters من محلول الليبيد والكلوروفورم بتركيز 25 milligrams per milliliter إلى دورق مستدير القاعدة سعة 25 milliliter. ثم جفف المحلول تحت غاز النيتروجين مع تدوير الدورق باستمرار حتى يتبخر كل الكلوروفورم.

وتغطي طبقة بيضاء رقيقة من الدهون النصف السفلي من الدورق بالكامل؛ جفف الدهون بشكل أكبر في مجفف تحت تفريغ هوائي طوال الليل. قم بتحضير محلول يتكون من 100 millimolar من نترات الصوديوم و25 millimolar من A NTS و10 millimolar من HEPs بدرجة pH سبعة. عند ضبط قيمة pH لهذا المحلول، تجنب استخدام أي محاليل تحتوي على الكلوريد.

بما أن مُخمد الثاليوم (thallium Quencher) يشكل معقداً غير قابل للذوبان مع الكلوريد في اليوم الثاني، قم بإعادة ترطيب الدهون في 1.67. ملليلتر واحد من هذا المحلول الإلكتروليتي للحصول على معلق دهني بتركيز 10 millimolar. وبمجرد الوصول إلى التركيز الصحيح، قم بتغطية الأنبوب بفيلم البارافيلوم (para film) ومزج المعلق جيداً باستخدام جهاز الفورتكس (vortex)، ثم احمِ العينة من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم واتركها لتتعتق في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

في اليوم الثالث، قم بمعالجة الخليط بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة باستخدام جهاز سونيكاتور منخفض الطاقة. بعد ذلك، قم بإجراء عملية التجميد والذوبان للعينة بوضعها على الثلج الجاف لمدة خمس دقائق، تليها خمس دقائق في ماء دافئ، وكرر دورة التجميد والذوبان من أربع إلى خمس مرات. ثم قم ببثق معلق الدهون باستخدام جهاز Avanti mini extruder.

قم بإعداد الباثق الصغير (mini extruder) باستخدام مرشح بولي كربونات بمسامية 0.1 ميكرون ودعامات ترشيح، ثم قم ببثق المعلق ذهاباً وإياباً 21 مرة حتى ينتهي الأمر بمعلق شبه شفاف في المحقنة المقابلة، مما ينتج عنه معلق من الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUV). قم بإزالة الـ A NTS الخارجية عن طريق تمرير المعلق المبثوق عبر عمود فصل PD 10 تم موازنته مسبقاً بمحلول صوديوم منظم. أضف 1.5 ملليلتر من معلق LUV بالإضافة إلى 1 ملليلتر من محلول صوديوم منظم إلى العمود.

بعد دمج المحلول بالكامل في العمود، استخلص الليبوزومات باستخدام ثلاثة مليليترات من منظم الصوديوم واجمع السائل المستخلص. يجب أن يحتوي محلول LUV المرجعي الناتج والمملوء بـ A NTS على حوالي أربعة إلى خمسة ملي مولار من الدهون ويظهر بشكل شفاف مائل للبياض الحليبي.

قم بحماية المحلول من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم واحفظه عند 13 degrees celsius، وقبل الاستخدام بـ 24 hours، قم برج المحلول جيداً باستخدام جهاز vortex. المحلول المخزن من LUV المملوء بـ A NTS. نظرًا لأن UUVs تمتلك كثافة أعلى من 1 g/mL، فإنها قد تترسب.

ثم قم بتخفيف المحلول المخزون من LUV المملوء بـ A NTS بنسبة 1 إلى 20 باستخدام منظم الصوديوم، ثم قم بتحضين ثلاثة أرباع الليبوزومات مع 260 nanogram من abidin في DMSO. أضف نفس الحجم من DMSO بدون gramin إلى الربع المتبقي.

للحفاظ على تركيز المذيب ثابتًا في جميع العينات، اترك الجرامين (gramin) ليتوازن بين الطبقتين الأحاديتين الداخلية والخارجية للحويصلات الدهنية لمدة 24 ساعة عند 13 درجة Celsius. هنا، يُستخدم مقياس طيف فلوري بنظام التدفق المتوقف (stopped flows spectro fluorimeter) من طراز applied photophysics SX point 20 مع التحكم في درجة الحرارة لقياس معدل إخماد الفلورة. للبدء، قم بتشغيل الأجهزة قبل ساعة من الموعد للسماح بإحماء الجهاز.

يجب أن يكون شق الإثارة بفتحة 1/1، كما يجب استخدام مرشح تمرير عالي 455 نانومتر لتسجيل الانبعاث باستخدام برنامج pro data SX. قم بضبط ظروف التسجيل أولاً، ثم اضبط أطوال موجات الإثارة في الموحد اللوني على 352 نانومتر. استخدم إعداد تثبيت الضغط.

اضبط الوقت على ثانية واحدة والنقاط على 5,000. عدل عدد التكرارات إلى تسعة لعمليات تشغيل المحلول المنظم وإلى 13 لعمليات تشغيل المطفئ. راقب درجة الحرارة في ملف تعريف فحص المحرك الخاص ببرنامج Essex.

يجب ضبط حجم الدفع على 120 µL، مما يمزج 60 µL من كل محقنة. وهذا يعطي وقتاً ميتاً يقدر بحوالي 1.2 ms. اضبط الجهد العالي أو الكسب في كاشف الفلورية على حوالي 420 volts.

الهدف هو الحصول على قراءة فلورية تبلغ حوالي ثمانية؛ قم بموازنة UUVs المحملة بـ A NTS والمجهزة مسبقاً لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام. بمجردما تتم الموازنة، قم برج العينة باستخدام جهاز المزيج الدوامي (vortex)، ثم قم بتحميلها في المحقنة اليسرى. وفي المحقنة اليمنى، قم بتحميل إما محلول الصوديوم المنظم أو thallium.Quencher.

قم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق تحريك المحاقن ذهاباً وإياباً. يجب تعبئة كلتا المحاقنتين بكميات متساوية. قبل إغلاق الصمامات للعينة الأولى، قم بتسجيل الفلورة باستخدام محلول صوديوم المنظم.

كرر العملية أربع مرات واضبط الكسب حسب الضرورة. ثم كرر العملية خمس مرات إضافية للعينات المتبقية. سجل تسع تكرارات باستخدام منظم الصوديوم.

استبدل منظم الصوديوم بمخمد الثاليوم وسجل 13 تكراراً. اشطف بالماء وتابع مع ضوابط العينات التالية. قم بتضمين عينات خالية من الجرامين ومع المذيب، وعينات خالية من الجرامين مع أقصى تركيز للمركب.

وبعد إجراء مقايسة الفلورة لكل من الجرامين والمذيب، يتم إدخال البيانات في برنامج MATLAB لتحليلها. بالنسبة لكل عينة، يتم قراءة جميع مكررات المحلول المنظم والمخمد، مع العلم أن المكررات الأربعة الأولى ستكون ملوثة بما كان موجوداً في الأنابيب سابقاً. وفي هذه الحالة، تأتي الإشارة من اختلاط عينة محلول الصوديوم المنظم بالماء من عملية الغسل السابقة.

تمثل التكرارات من الخامس إلى التاسع الإشارة القادمة من العينة وحدها. وبناءً على ذلك، نقوم دائمًا باستبعاد التكرارات الأربعة الأولى في كل حالة. ولتجنب أي شوائب ناتجة عن عملية الخلط، يتم فحص الآثار يدويًا وإزالة أي تكرارات غير صالحة، مثل الأثر الأحمر الذي يحتوي على طفرات أو انحرافات ناتجة عن شوائب الخلط أو الفقاعات.

بعد ذلك، قم بتطبيع تكرارات الإخماد (quencher repeats) بناءً على متوسط القيمة الابتدائية لتكرارات المحلول المنظم لكل عينة في كل حالة تجريبية، ثم ادمج متوسطات جميع العينات في رسم بياني واحد؛ حيث يجب أن تكون عينات التصور التي لا تحتوي على gramine متشابهة جميعاً وتظهر انعداماً شبه تام لإخماد الفلورة. هناك انخفاض بطيء في إشارة الفلورة نتيجة لدخول أيونات thallium ببطء إلى الحويصلات في العينات التي تحتوي على gram sidin. إذا تغير المسار الزمني للفلورة بشكل مرئي بفعل المركب، فإن ذلك يعني أن المركب يغير خصائص الطبقة الدهنية المزدوجة عند التركيز المختبر، ثم قم بمطابقة دالة أسية ممتدة (stretched exponential) مع أول 2 إلى 100 milliseconds من منحنيات إخماد الفلورة المطبعة.

قم بإجراء التكرارات الفردية وحساب المعدل عند مللي ثانية اثنين. ثم احسب المتوسطات والانحرافات المعيارية لعينة معينة من التكرارات الفردية. لوحظ تأثير الكابسيسين، والذي يرمز له هنا بـ cap، على المسار الزمني للخمود الفلوري في غياب أو وجود الغرامين، والذي يرمز له بـ ga، وتظهر هنا إشارة الفلورة المعيرة على مدى ثانية واحدة. تمثل النقاط الرمادية النتائج من جميع التكرارات، بينما تمثل الخطوط الحمراء المتوسطات.

يظهر الجزء الأول الذي تبلغ مدته 100 مللي ثانية من إشارة الفلورة المُطبعة. تمثل النقاط الرمادية نتائج تكرار واحد لكل حالة. أما الخطوط الحمراء فهي تمثل ملاءمة الأسية الممتدة (stretched exponential fits) لهذه التكرارات.

يشير الخط الأزرق المتقطع إلى علامة الثانيتين. وهو الوقت الذي يتم عنده تحديد معدل الإخماد. ويتم تحديد التغير النسبي في معدل الإخماد عن طريق تطبيع البيانات مقارنة بعينة الضبط التي تحتوي على gramin وبدون أي معدِّل.

عندما يمتص الكابسيسين في الطبقة الدهنية المزدوجة، فإنه يغير خصائص هذه الطبقة. سينعكس هذا التغيير نحو طبقة مزدوجة أكثر ليونة في شكل إزاحة في جانب الجرام في توازن المونومر والدايمر لصالح الدايمر الموصل. لقد عرضنا لكم للتو إجراءً لقياس تأثيرات الاضطراب في الطبقة المزدوجة الناتجة عن جزيء صغير.

عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام الضوابط المناسبة لكل تجربة باستخدام نفس دفعة الحويصلات. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.