والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد عقاقير جديدة تعمل على تعديل قنوات grk. ويتم تحقيق ذلك من خلال زراعة خلايا A TT 20 أولاً في طبق يحتوي على 96 بئراً. وتتمثل الخطوة الثانية في تخفيف المركبات المختبرة باستخدام نظام Verset للتعامل مع الأطباق السائلة.

بعد ذلك، يتم تطبيق المركبات المختبرة المخففة على الخلايا باستخدام الـ verset. وتتمثل الخطوة النهائية في إدخال لوحة 96 بئراً في قارئ الألواح الفلوري Synergy two، وحقن محاليل الضبط والسوماتوستاتين في الآبار. وفي النهاية، يُستخدم قارئ الألواح الفلوري لتحديد المركبات التي تغير الإشارة الفلورية المستحثة بواسطة السوماتوستاتين، وبالتالي تعدل قنوات Grk.

تكمن ميزة هذا الإجراء مقارنة بالطرق الحالية مثل تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording)، في إمكانية فحص عدد كبير من المركبات بسرعة لتحديد ما إذا كانت تعدل قنوات gerk. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج الألم، حيث يمكن تحديد المركبات التي تنشط قناة Gerk، مما يؤدي إلى تثبيط النقل العصبي للألم في FI. وتقوم ماريبيل فاسكيز بتوضيح إجراءات طلاء الأطباق ذات الـ 96 بئراً وزراعة الخلايا.

يبدأ الطالب في مختبري هذا الإجراء بزراعة خلايا النخامية A TT 20 في وسط DMEM مضاف إليه 10% horse serum عند درجة حرارة 37 degrees Celsius في جو رطب يحتوي على 5%CO2. يتم الحفاظ على المزرعة عن طريق استزراع الخلايا فرعياً كل خمسة إلى سبعة أيام باستخدام إجراء معايرة قياسي. بعد ذلك، يتم طلاء آبار الصفيحة السوداء الشفافة.

لوحة ذات 96 بئراً في القاع تحتوي على 50 µL من poly L lysine. تُترك الآبار لتجف لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. بعد ذلك، يتم إزالة poly L lysine الزائد وتُزرع الخلايا في اللوحة ذات الـ 96 بئراً التي تحتوي على 200 µL من الوسط الغذائي بكثافة 30,000 خلية لكل بئر.

بعد ذلك، يتم تخزين الخلايا في الحاضنة لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أيام. استخدم جهاز شفط لسحب وسط الزرع ببطء من الطبقة الخلوية أحادية الطبقة، ثم اغسل الخلايا بـ 200 microliters من محلول منظم عادي. لاحقاً، أضف 200 microliters من المحلول المنظم الذي يحتوي على صبغة حساسة لجهد الغشاء إلى كل منها.

تُحضن الخلايا لمدة 40 دقيقة عند 37 °C. بعد مرور 40 دقيقة، تُخرج خلايا A TT 20 من الحاضنة وتُترك حتى تعود إلى درجة حرارة الغرفة، ثم يُسحب المحلول المنظم القديم. بعد ذلك، يُضاف محلول منظم جديد يحتوي على MPD إلى الخلايا.

بعد ذلك، استخدم نظام مناولة السوائل لإضافة تركيزات مختلفة من المركبات المختبرة ومحاليل الضبط إلى الخلايا. وفي طبق ذو 96 بئراً، قم بتحضين الخلايا لمدة خمس دقائق مع المركبات المختبرة قبل إجراء القياسات الفلورية. وفي هذا الإجراء، أدخل الطبق ذو 96 بئراً في قارئ الأطباق الفلوري biotech synergy two.

قم بقياس إشارة الخلفية الفلورية عند طول موجي للإثارة يبلغ 520 nanometers وطول موجي للانبعاث يبلغ 560 nanometers. بعد ذلك، أضف ربيطات G PCR R أو المحلول الضابط إلى الآبار لتنشيط قنوات GIR باستخدام نظام الحقن Synergy two. ثم قم بجمع نقاط البيانات على فترات زمنية مدتها عشر ثوانٍ على مدار فترة أخذ عينات مدتها 302 ثانية.

عند أطوال موجات الاستثارة والانبعاث. احسب معامل Z لتحديد مدى موثوقية المقايسة. تشير قيم معامل Z التي تتراوح بين 0.5 و 1.0 إلى أن جودة المقايسة ممتازة.

يتم استبعاد الأطباق التي تكون فيها قيم Z factors أقل من 0.5. ومن خلال التحليل، يتم إعادة اختبار المركبات التي تعدل الإشارة الفلورية في وجود 2 mM من كلوريد الباريوم أو 500 nM من terapin Q لتأكيد خصوصية قناة البوتاسيوم المقومة للداخل؛ يظهر هنا تمثيل للإشارة الفلورية لـ HLB 0 2 1 1 15 2 مقاسة بمرور الوقت في خلايا A TT 20 مع إضافة السوماتوستاتين أو المحلول الضابط. تم حساب نسبة شدة الفلورية في محور Y عن طريق قسمة الإشارة في وجود السوماتوستاتين أو المحلول الضابط على إشارة الخط القاعدي المقاسة قبل إضافة السوماتوستاتين أو المحلول الضابط.

يظهر هناتأثير معالجة خلايا A TT 20 بـ 500 nano molars. يثبط Terapin Q الانخفاض في الإشارة الفلورية الناتج عن السوماتوستاتين من خلال الارتباط بـ وقطع قنوات G. ويظهر هنا تأثير معالجة خلايا A TT 20 بـ 20 micromolar من البروبافينون، والذي يثبط أيضاً الانخفاض في الإشارة الفلورية الناتج عن السوماتوستاتين. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين إذا طُبقت بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الأدوية التي تعدل قنوات grk باستخدام قارئ أطباق فلوري.