Electroeluting شظايا الحمض النووي

مرحباً. سنوضح لكم اليوم كيفية إجراء عملية الاستخلاص الكهربائي (electrolution) بهدف تنقية قطع DNA، مثل نواتج الهضم الإنزيمي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ويمكن أن يكون الاستخلاص الكهربائي أحد الطرق المفضلة لأغراض أخرى مثل الاستنساخ والتسلسل الجيني. وبناءً على الشحنة الكهربائية السالبة لـ DNA، يتم وضع حاجز خلوي مرتفع ضمن المجال الكهربائي، مما يؤدي إلى ترسيب القطع ومنع هجرتها بشكل أكبر.

تتيح هذه الطريقة تنقية مجموعة واسعة من أحجام قطع DNA من مصادر مختلفة بكفاءة عالية نسبياً تصل إلى 80%. وتمثل تكلفتها المنخفضة ميزة أخرى لعملية الاستخلاص الكهربائي (electro elution) عند مقارنتها بطرق التنقية الأخرى مثل الأعمدة ومجموعات الراتنج (resin kits)، وغيرها. يتم أولاً فحص عينة DNA عن طريق الفصل الكهربائي للهلام (agarose gel electrophoresis) المصبوغ بـ ethidium bromide من أجل رؤية وتحديد القطعة المراد تنقيتها، ومن ثم يجب المضي قدماً في عملية الفصل الكهربائي.

عندما تكون القطع مفصولة جيداً، يمكن تحديد القطع ذات الحجم الأصغر بدقة. وبعد عملية الترحيل الكهربائي، يتم استئصال القطعة المطلوبة بدقة من الهلام باستخدام شفرة حلاقة جديدة، مع الحرص على قطع شريحة الهلام بحيث تكون أقرب ما يمكن من الحزمة المستهدفة.

يجب تنفيذ هذا الإجراء مع توفير الحماية المناسبة من الأشعة فوق البنفسجية وارتداء القفازات. بعد ملء جهاز الـ electro luter بمحلول الاستخلاص (burning buffer) المناسب مع الحرص على غمره لسطح الهضبة الوسطى، توضع شريحة الهلام داخل إحدى العجلات بحيث تكون أقرب ما يمكن من القناة V. يجب ألا تتواجد أي فقاعات داخل القناة vch.

يمكن تجنب ذلك عن طريق غسل القناة بالمحلول المنظم لإزالة أي هواء محتبس. بعد ذلك، تُضاف 100 µL من حاجز الملح العالي بعناية إلى القناة V من الموقع القريب من البئر. يتم إغلاق الغرفة وتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة لبدء عملية الاستخلاص الكهربائي بجهد يتراوح من 100 إلى 120 فولت.

سيعتمد الفاصل الزمني على حجم القطعة؛ فبالنسبة للقطع الكبيرة التي تصل إلى 20 kbs، قد تكون فترة من 50 دقيقة إلى ساعة واحدة كافية، أما القطع الصغيرة فيجب مراقبتها كل 10 دقائق باستخدام الأشعة فوق البنفسجية UV لتجنب المزيد من الاستخلاص عبر المحلول الملحي وصولاً إلى سلسلة منظم التوازن النهائية. في هذه الحالة، قمنا بهضم 560 nanograms من البلازميد باستخدام إنزيمات ND one و entry لتحرير قطعة بحجم 900 base per، وهو ما يعادل 84 nanograms من العينة.

وبناءً على ذلك، بعد وضع شريحة الهلام داخل البئر، تبدأ عملية الاستخلاص الكهربائي (electro elution) لمدة 25 دقيقة عند 100 فولت. وبمجرد اكتمال الاستخلاص الكهربائي واحتجاز قطع DNA في الوسادة السفلية داخل القناة V، يتم استعادة 400 µL من المحلول من القناة، من الجانب القاصي للمستقبل، ووضعها في أنبوب دقيق سعة 1.5 µL باستخدام طرف دقيق متصل بماصة دقيقة (micropipette)، ثم يتم البدء في الترسيب بالكحول عن طريق إضافة حجمين من الإيثانول المطلق البارد والمزج بواسطة جهاز الرج (vortex). بالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة 2 إلى 3 µL من الغليكوجين لتحسين حصيلة استعادة DNA؛ تُحفظ الأنابيب عند -20 °C لمدة ساعة واحدة أو بدلاً من ذلك تخزن عند درجة الحرارة هذه طوال الليل، ثم يتم إجراء الطرد المركزي عند 4 °C بأقصى سرعة لمدة 25 دقيقة.

اغسل هذه الرواسب من خلال إضافة 1 مل من الإيثانول البارد بتركيز 70%. قم بالطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C بالسرعة القصوى لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي واتركه ليجف في درجة حرارة الغرفة مع وضع الأنابيب في وضع مقلوب، ثم أعد تعليق الرواسب في 10 إلى 15 µL من الماء الخالي من النوكلياز، وتابع لتحديد تركيز العينة. في هذه الحالة، تمت إعادة تعليق العينة المنقاة في 10 µL من الماء وتقدير كميتها باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند طول موجي 260 نانومتر، مما أظهر تركيزاً قدره 6.3 ng/µL، وهو ما يمثل كفاءة بنسبة 75%. قد تعتقد أن استثمار 10 دقائق فقط من وقتك الثمين في استخدام طقم جاهز سيكون خياراً أفضل.

ومع ذلك، وبالرغم من الوقت المستغرق في هذه العملية، ستتمكن من التحكم في العديد من المتغيرات التي ستسمح لك بتنقية نطاق أوسع من العينات ذات الأحجام والمصادر المختلفة بطبيعتها. وكما رأيت في هذه الحالة، لوحظت كفاءة بنسبة 75%، وهي نتيجة تعادل أو تفوق معظم أطقم تنقية DNA. نشكركم على انضمامكم إلينا اليوم.

نأمل أن تكونوا قد وجدتم هذا البروتوكول مفيداً في مشاريعكم البحثية.