الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف السريع عن وجود بكتيريا محددة مثل e coli باستخدام مجسات DNA Zyme الفلورية المبتكرة. أولاً، يتم توليد مجسات DNA Zyme الجينية عن طريق الربط. ثم تُزرع البكتيريا لإثراء عدد الجزيئات المستهدفة، ويتم تحضير خليط خارج خلوي من السائل الطافي.

يتم بعد ذلك دمج الخليط الخام خارج الخلية مع مسبار DNA zyme، حيث يؤدي التفاعل بين مسبار DNA Zyme والجزيئات المستهدفة إلى شطر المسبار، والذي يصبح عندها فلورياً. ويتم الكشف عن ذلك باستخدام مقياس الفلورة (fluorimeter)، حيث يظهر التفاعل بين المسبار والهدف على شكل زيادة في الفلورة النسبية. ثم يتم التحقق من النتائج باستخدام تحليل الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد في ظروف مسخنة (denaturing poly acrylamide gel electrophoresis).

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بطريقة PCR أو الطرق القائمة على الأجسام المضادة في أن الإجراء أبسط وأسهل في التنفيذ. وعلى الرغم من تطوير هذه الطريقة باستخدام البكتيريا النموذجية e coli، إلا أنه يمكن تطبيقها للكشف عن أي من مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى المنقولة بالغذاء أو المكتسبة من المستشفيات. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنهم قد لا يكونون معتادين على التعامل مع مجسات DNA الاصطناعية والبكتيريا. ويقوم بشرح الإجراء في هذا البروتوكول كل من سيرجيو أغويري، وهو مساعد بحث من مختبري، ومنصو علي، وهو زميل ما بعد الدكتوراه.

إن R-F-D-E-C one هو DNA Zyme المميز. ويتكون من التسلسل الحفزي EC one الذي تحته خط باللون الأسود، وتسلسل الركيزة FS one الذي تحته خط باللون الأخضر، وتحتوي الركيزة على رابطة RNA يشار إليها بالحرف r باللون الأزرق، يحيط بها DT مُعلم بفلور يشار إليه بالحرف F، وDT مُعلم بمخمد يشار إليه بالحرف queue. أما RF SS one فهو نسخة مبعثرة من RFD EEC one حيث تم خلط التسلسل الحفزي EEC one جزئياً في SS one، بينما ظل جزء FS one دون تغيير. يتم تحضير RF DEC one و RF SS one عن طريق الربط الإنزيمي بوساطة قالب للأوليغونوكليوتيد FS one مع الأوليغونوكليوتيد EC one أو SS one بوجود LT one كقالب للربط لتحضير مخاليط خارج خلوية خام (cems) والتي ستُستخدم كهدف لـ R-F-D-E-C one. ابدأ بتوزيع 2 mL من LB في أنابيب زراعة معقمة سعة 14 mL باستخدام مسدس ماصة.

بعد ذلك، وباستخدام رأس ماصة معقم، يتم نقل مستعمرة واحدة من بكتيريا e coli من طبق آغار وإسقاطها في أنبوب زراعة يحتوي على lb. توضع الأنابيب في حاضنة مضبوطة عند 37 °C وتُرج بسرعة 250 RPM لمدة 14 ساعة بعد التحضين. ولتوليد مزرعة تلقيح بنسبة 1%، يتم توزيع 2 mL من LB الطازج في أنابيب زراعة سعة 14 mL، ثم إضافة 20 µL من المزرعة البكتيرية من الخطوة السابقة.

قم بتحضين الأنابيب عند 37 درجة Celsius مع الرج بسرعة 250 RPM حتى يصل كل محلول بكتيري إلى OD 600 يبلغ حوالي واحد. انقل 1 milliliter من كل مزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 milliliter وقم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 11,000 G لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد، انقل المادة الطافية الرائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 milliliter.

يُخزن السائل الطافي عند درجة حرارة -20 °C. وفي حال عدم استخدامه فوراً لتحديد ما إذا كانت الإشارة الفلورية قد تولدت نتيجة تفاعل إنزيمات DNA مع المستخلص الخلوي الخام، يتم تحليل العينات باستخدام قياس الطيف الضوئي. قم بتشغيل جهاز قياس الطيف الفلوري وضبط معايير الحصول على البيانات مع ضبط طول موجة الإثارة عند 488 nanometers وطول موجة الانبعاث عند 520 nanometers.

قم أيضاً بضبط الجهاز لأخذ القراءات كل دقيقة لمدة ساعة واحدة. اغسل ثلاث كوفيتات من كريستال الكوارتز أولاً بالماء المقطر منزوع الأيونات ثم بالإيثانول 100%. جفف الكوفيتات عن طريق نفث غاز النيتروجين.

قم بتسمية الكوفيتات بـ C1 للمجموعة الضابطة الأولى، وC2 للمجموعة الضابطة الثانية، وT للعينة المختبرة. بعد ذلك، انقل 24 µL من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى C1، و24 µL من مزيج الإفرازات الخارجية الخام لـ e coli المُحضّر إلى كل من C2 وT. أضف 25 µL من 2X RB إلى كل كوفيت وضعها في مطياف الفلورة. ابدأ في جمع بيانات الفلورة، وبعد خمس دقائق، أضف 1 µL من 5 µM RFS S1 إلى C2، و1 µL من 5 µM RFD eec1 إلى T وC1، مع ضمان عدم انقطاع قراءات الفلورة. اخلط كل محلول عن طريق الماصة، ثم اترك التفاعل يستمر للفترة المتبقية من مدة الحصول على البيانات.

احفظ البيانات بتنسيق ملف Excel. ثم انقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي واستخدم برنامج Excel لإنشاء صورة رسومية. استخدم نفس مخاليط التفاعل التي استُخدمت للتحليل بواسطة Spectra.

يمكن استخدام القياس الضوئي للتحليل بواسطة الفصل الكهربائي للهلام. بعد ساعة واحدة من عملية الاستحواذ، قم بإزالة الكيوفيتات من جهاز المطياف الضوئي وانقل المحاليل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة.

أوقف التفاعلات بإضافة 5 µL من خلات الصوديوم بتركيز 3 M و125 µL من الإيثانول 100%. اخلط كل محلول باستخدام جهاز الرج المداري (vortex)، ثم ضع الأنابيب في مجمد عند درجة حرارة -20 °C لمدة ساعة واحدة بعد عملية الحضانة. قم بإجراء طرد مركزي لخليط التفاعل عند 11,000 G لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم أزل السائل الطافي بعناية باستخدام الماصة.

جفف الكريات باستخدام مُركز DNA لمدة 10 دقائق. أضف 20 µL من منظم تحميل الهلام (gel loading buffer) ومزجها سريعاً باستخدام جهاز vortex. قم بطرد المكونات لأسفل لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي.

بعد ذلك، قم بتحميل 10 µL من عينات التفاعل في كل بئر من هلام 10%Dage بعد انتهاء التشغيل. قم بإزالة الصفائح الزجاجية واغسلها جيداً بمياه الصنبور. ولإزالة أي قطع متبقية من الهلام، امسح الصفائح باستخدام منديل Kim wipe.

افحص لوح الهلام للكشف عن الفلورة باستخدام ماسح ضوئي typhoon. قم بتحليل الصور الناتجة باستخدام برنامج image quant لتقييم حساسية النظام. تُزرع المزارع المخففة تسلسلياً لفترات زمنية متزايدة.

لتحديد الحد الأدنى من فترة التحضين اللازمة للكشف عن بكتيريا واحدة، قم بتجهيز 10 أنابيب زراعة تحتوي كل منها على 2 mL من lb، ثم قم بتلقيح كل مزرعة بـ 100 µL من مخزون جليسرول لبكتيريا e coli بتركيز 2 CFU/mL، وحضنها عند 37 °C مع الرج بسرعة 250 RPM لمدة 4 و8 و12 و16 و24 ساعة. يتم جمع 300 µL من كل أنبوب من أنابيب الزراعة الملقحة، مع العلم أنه قد لا تكون هناك بكتيريا يمكن الكشف عنها في العينات التي تم جمعها عند النقاط الزمنية 4 و8 و12 ساعة.

اترك المزرعة المتبقية لتنمو لمدة 24 ساعة من أجل تحديد المزارع التي تحتوي على بكتيريا. قم بقياس OD 600 ورسّب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 11,000 G لمدة خمس دقائق. انقل الطافي الذي يحتوي على CEMS إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 milliliter، واحفظها عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius حتى استخدامها في اليوم التالي.

افحص المزارع للتحقق من النمو. قد تحتوي واحدة أو اثنتان فقط من المزارع العشر على e coli بعد التلقيح، بينما لن تحتوي الأنابيب المتبقية على أي خلايا. استخدم CEMS المستخلصة من المزارع الإيجابية عند النقاط الزمنية المحددة لتحضير تفاعلات الانقسام باستخدام RFD EEC one، وحلل مخاليط التفاعل باستخدام الفصل الكهربائي لهلام DAGE كما تم وصفه سابقاً؛ حيث تم تحضير كل من مسباري RFD EEC one و RF SS one عن طريق الربط الإنزيمي لأجزاء DNA zyme بالركيزة.

تم تقييم التفاعل بين CEM EEC وRFD EEC أو RF SS باستخدام القياس الطيفي. كما يظهر هنا، أنتج R-F-D-E-C مستوى عالٍ من الإشارة الفلورية عند إضافة CEM ec.

وفي تباين صارخ، لم ينتج R FS S one إشارة فلورية قوية. وبذلك، فإن وظيفة إنتاج الفلورة لـ RFD EEC one، عند ملامسة CEM EC، يتم تسلسلها.

تحديداً للتحقق من أن الزيادات الملحوظة في الفلورة كانت ناتجة عن قطع الرابطة RNA. تم تحليل خلائط التفاعل عن طريق قطع RFD eec؛ حيث من المتوقع أن يؤدي استخدام 0.25 molar من هيدروكسيد الصوديوم إلى توليد شظايا 2D NA، شظية في الطرف '5 تحتفظ بالفلور وشظية في الطرف '3 تحتفظ بالمخمد. كما يمكن رؤيته هنا.

لقد أنتج خليط تفاعل RFD EEC CEM EEC بالفعل ناتج الانقسام المتوقع. علاوة على ذلك، كانت UNC هي الوحيدة التي قامت بشطر R-F-D-E-C، وكان من الممكن الكشف عن قطعة النهاية 5' عن طريق التصوير الفلوري. ولفحص خصوصية RFD EEC، أُجريت مقايسات فلورية باستخدام CEMS التي تم جمعها من عدة أنواع أخرى من البكتيريا سالبة الجرام وموجبة الجرام فقط.

أدت العينة التي تحتوي على CEM EC إلى زيادة في الفلورة. ويشير عدم وجود تفاعل تبادلي مع CEMS من البكتيريا الأخرى إلى أن R-F-D-E-C one يتمتع بانتقائية عالية تجاه e coli. ولتحديد الحد الأدنى من وقت الزرع المطلوب للكشف عن خلية e coli واحدة، تم تخفيف e coli إلى 1 CFU لكل مليلتر في 100 µL وزرعها في وسط نمو لمدة 4 و8 و12 و16 و24 ساعة. ثم خُلطت CEMS الناتجة مع R-F-D-E-C one، وقُيِّم الانقسام بواسطة dage كما هو موضح هنا.

تشير صورة مقايسة Dage إلى أن R-F-D-E-C 1 لم ينتج منتج الانقسام المتوقع. وعند التفاعل مع CEM، تم جمع ECS عند أربع وثماني ساعات من النمو، مما يشير إلى أن وقت استزراع لمدة 12 ساعة مطلوب بمجرد إتقان العملية.

تتمثل المكون الرئيسي لهذه التقنية في إمكانية إجراء المقايسة القائمة على إنزيم DA في غضون 60 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح بعد هذا التطوير. وقد مهد هذا الإجراء الطريق للباحثين في مجال التحليل الحيوي لاستكشاف إنزيمات DNA خيفية (allogenic) للكشف عن مجموعة واسعة من المسببات المرضية البكتيرية.