تحديد عدد الخلايا خلال زراعة الخلايا باستخدام خلية مكافحة الصولجان

يعد جهاز Scepter لعد الخلايا جهازاً آلياً محمولاً لعد الخلايا ومراقبة قطرها وحجمها، والتحقق من صحة وجودة المجموعات الخلوية. ويقدم هذا الجهاز مزايا كبيرة مقارنة بطرق العد الأخرى، بما في ذلك تحسين الدقة، وسهولة الاستخدام، والتكلفة المنخفضة لعد الخلايا. عند استخدام جهاز Scepter، اتبع التعليمات الظاهرة على شاشته الرسومية لسحب الخلايا إلى المستشعر المخصص للاستخدام مرة واحدة.

يتم بعد ذلك عد الخلايا ويقوم الجهاز بإصدار تقارير عن تركيزات الخلايا والإحصائيات، والتي يمكن رفعها إلى جهاز كمبيوتر وتحليلها. مرحباً، أنا سونيا، باحثة علمية هنا في Millport، وسأوضح لكم اليوم كيفية استخدام جهاز scepter.

عداد الخلايا يعد عد الخلايا خطوة ضرورية ولكنها مرهقة في زراعة الخلايا في المختبر. وتضمن تركيزات الخلايا المتسقة إمكانية تكرار التجارب ودقتها. كما أن أعداد الخلايا مهمة لمراقبة صحة الخلايا ومعدل تكاثرها، وتقييم الخلايا الخالدة أو المحولة الملقحة للتجارب اللاحقة، أو عملية عفن الخلايا (transfection) أو العدوى، والتحضير للمقاييس القائمة على الخلايا على الرغم من الحاجة إلى السرعة والدقة.

فيما يتعلق بعدّ الخلايا، يقوم 71% من أصل 400 باحث شملهم الاستطلاع بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). وبالرغم من أن استخدام مقياس كرات الدم غير مكلف، إلا أنه يتطلب جهداً كبيراً ويخضع لتحيز المستخدم وسوء الاستخدام، مما يؤدي إلى نتائج عد غير دقيقة. وتشمل مصادر الخطأ في استخدام مقياس كرات الدم التوزيع غير المتساوي للخلايا في العينة، أو وجود عدد كبير جداً أو قليل جداً من الخلايا في العينة.

تعتمد القرارات الذاتية على ما إذا كانت خلية معينة تقع ضمن منطقة العد المحددة. ويؤدي تلوث مقياس كرات الدم (hemo cytometer)، والتباين في أداء المستخدم، والتباين في معدل ملء مقياس كرات الدم إلى تخفيف الرتابة المرتبطة بالعد اليدوي. ويقوم 29% من الباحثين بعد الخلايا باستخدام أجهزة عد الخلايا الآلية.

ومع ذلك، يمثل السعر المرتبط بهذه الأجهزة المكتبية الضخمة عائقاً أمام استخدامها بالنسبة لمعظم الباحثين. ويعد جهاز scepter cell counter جهازاً محمولاً وآلياً يوفر دقة وأتمتة عدّ خلايا Coter بتكلفة منخفضة نسبياً وفي تنسيق محمول سهل الاستخدام. يعتمد النظام على مبدأ Coter للكشف عن الجسيمات القائم على الممانعة بتنسيق مصغر، وذلك باستخدام مزيج من الأجهزة التناظرية والرقمية لمعالجة إشارات الاستشعار، وتخزين البيانات، والعرض الرسومي.

تم تصميم المستشعر الذي يستخدم لمرة واحدة بمنطقة استشعار خلوية مصنعة دقيقاً، مما يتيح التمييز حسب حجم الخلية وحجمها بدقة دون الميكرون ودون البيكوليتر، معززة بقنوات دقيقة للتعامل مع السوائل وأنظمة إلكترونية. يقوم عداد الخلايا scepter بعرض إحصائيات المجتمع الخلوي بيانياً على شكل مدرج تكراري للاستخدام. يبدأ العمل بعداد الخلايا scepter بتخفيف معلق خلوي أحادي الخلايا في محلول ملحي منظم بالفوسفات.

يُعد التركيز من 10,000 إلى 500,000 خلية لكل مليلتر هو التركيز الأمثل. انقل 100 µL من الخلايا المخففة إلى أنبوب microview سعة 1.5 مليلتر. قم بتشغيل عداد الخلايا scepter عن طريق الضغط مع الاستمرار على مفتاح التشغيل الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز، وانتظر ظهور التعليمات على الشاشة.

عندما يطلب منك الجهاز ذلك، قم بتثبيت مستشعر في نهاية وحدة الـ scepter بحيث تكون لوحة استشعار القطب الكهربائي مواجهة للجزء الأمامي من الجهاز. تتكون مستشعرات Scepter من غرفة أخذ عينات مصبوبة بدقة مع منطقة استشعار إلكترونية وأقطاب كهربائية مدمجة لاستشعار الخلايا. وتتيح هذه المستشعرات إمكانية التمييز بين أحجام الخلايا بدقة دون الميكرون، وحجم الخلية بدقة دون البيكولتر.

يضمن الهندسة المتسقة للمستشعر عدّ أحجام متساوية من العينات وإجراء قياسات دقيقة للحجم. بمجرد توصيل المستشعر، قم بتنفيذ كل خطوة من عملية العد وفقاً للتعليمات التي تظهر على الشاشة كما يلي. عندما تظهر على الشاشة عبارة "hold down the plunger to begin"، ابدأ بالضغط على المكبس، ثم ستظهر على الشاشة عبارة "submerge the sensor"، عندها قم بغمر المستشعر في محلول معلق الخلايا، ثم حرر المكبس لسحب معلق الخلايا إلى داخل المستشعر.

يعمل المكبس كإشارة كهربائية وسيقوم بسحب العينة بالإضافة إلى الحجم الميت إلى المستشعر. ولا تهم سرعة أو دقة الكبس كما هو الحال في عملية الماصة. ستستغرق هذه العملية عدة ثوانٍ عند جاهزيتها.

سيصدر الجهاز صوت تنبيه وتظهر عبارة "تم تحميل العينة" على الشاشة. وبمجرد تحميل العينة في المستشعر، يتم سحبها عبر منطقة الاستشعار لتقييم حجم الخلية وحجم السيتوبلازم. ثم تمر عبر القنوات الدقيقة، وبمجرد عد 50 µL من العينة، يرسل المستشعر إشارة إلى الجهاز لإيقاف عملية العد.

بعد اكتمال عملية العد، ستظهر على شاشة الجهاز عبارة count complete. يُرجى إزالة المستشعر والتخلص منه. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لإزالة المستشعر والتخلص منه.

سيعرض الجهاز بعد ذلك مدرجاً تكرارياً لحجم الخلايا أو قطرها على شاشته، بالإضافة إلى تركيز الخلايا لكل مليلتر. وبعد اكتمال عملية العد وعرض المدرج التكراري على الجهاز، يتم تطبيق البوابات (gates) بالضغط على زر التبديل، ثم اختر "التحديد التلقائي للبوابات" (auto gating) أو "استخدام الأخير" (use last) إما لضبط البوابة تلقائياً بناءً على مخطط المدرج التكراري أو لاستخدام البوابات من عملية العد السابقة. وبغض النظر عن الخيار المحدد، يمكن تحريك البوابات يدوياً للضبط الدقيق.

قم بضبط البيانات، ثم اضغط على زر التبديل مرة أخرى لتحديد البوابة اليسرى وقم بتحريك زر التبديل لنقل البوابة كما هو مطلوب. بعد ذلك، اضغط على زر التبديل مجدداً لتفعيل البوابة اليمنى وقم بتحريك زر التبديل لوضع البوابة اليمنى. انقر مرة أخرى.

سيتم عرض تركيز خلوي جديد، ومتوسط حجم الخلية وقطرها. يمكن أيضاً تحريك مفتاح التبديل إلى أي من الجانبين للتبديل في العرض بين التاريخ والوقت، ومتوسط حجم الخلية، ومتوسط حجم الخلية، حيث يمكن تخزين ما يصل إلى 72 مخططاً بيانيًا (histogram) على الجهاز نفسه. ولتحميل البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي، قم بتوصيل الجهاز عبر منفذ كابل USB، ليظهر ذلك على شاشة العرض في الكمبيوتر الشخصي.

انقر نقراً مزدوجاً على تطبيق برنامج scepter لتشغيل البرنامج. ثم انقر على connect. ستنتقل جميع القراءات تلقائياً إلى البرنامج.

يعرض برنامج تطبيق scepter المدرج التكراري الذي يوضح توزيع عشيرة المزرعة إما من حيث الحجم أو القطر. ويمكن بعد ذلك تصدير الملفات التي تم تنزيلها إلى Microsoft Excel، حيث يتم عرض البيانات الخام في فئات من أقطار الخلايا أو أحجام الخلايا المحددة. تم تحضير 19 خطاً خلوياً مختلفاً للعد، وحُددت التركيزات الابتدائية النظرية باستخدام عداد الخلايا.

تم بعد ذلك تخفيف هذه المعلقات الخلوية بشكل أكبر للحصول على معلقات خلوية بتركيزات خلوية نظرية. ثم استُخدم عداد الخلايا scepter لتحديد التركيزات الخلوية. يوضح هذا الشكل خمسة تخفيفات تم قياسها لخمسة خطوط خلوية ممثلة، إلى جانب التركيز الخلوي النظري.

تُظهر الدرجة العالية من الخطية، كما تشير قيم r-squared، أن عد الخلايا باستخدام scepter هو طريقة موثوقة لخطوط الخلايا التي تم اختبارها عبر نطاق تشغيل خطي واسع. ويتم هنا توضيح الدقة النسبية الإجمالية لعد scepter، حيث تمت مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها من عد scepter مع التعدادات التي تم الحصول عليها من عد coter. وقد تم رسم لوغاريتم تعدادات خلايا scepter مقابل لوغاريتم تعدادات coter، مما يظهر أن تعدادات scepter تتطابق مع تعدادات coter في جميع خطوط الخلايا التي تم اختبارها.

تم إجراء عدّ لـ 19 خطاً خلوياً باستخدام عداد Z two coulter. كما تم إجراء العدّ باستخدام عداد الخلايا scepter، وهو عداد آلي يعتمد على الرؤية، ونظام V cell أو count test، وجهاز hemo TER، وذلك وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة وباستخدام نفس المعلق الخلوي الابتدائي وتخفيفات متطابقة. وتظهر النتائج الموضحة في هذا الشكل أن تركيزات الخلايا المقاسة بواسطة عدّ scepter تتطابق بشكل وثيق مع تركيزات الخلايا النظرية وبخطية عالية.

تم حساب النسبة المئوية لمعامل الاختلاف أو CV لكل تخفيف من كل خط خلوي. وبالنسبة لكل نظام عدّ موضح هنا، تظهر متوسطات النسبة المئوية لـ CV عبر 19 خطاً خلوياً فيما يتعلق بتركيز الخلايا وطريقة العد ضمن نطاق التشغيل. يعد عداد الخلايا scepter أكثر دقة من العد باستخدام hemo cytometer، حيث يُظهر انحرافات معيارية أصغر ومتوسطات أصغر لمعاملات الاختلاف.

تعتبر عملية العد باستخدام جهاز Scepter أسرع بـ 10 مرات من العد باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometry)، كما أنها أسرع من أجهزة العد الآلية الأخرى أيضاً. هنا، تم عد خلايا SF nine وMCF seven وHC 2 93 باستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو، وتم تسجيل متوسط الوقت المطلوب لقياس تركيز الخلايا.

لاحظ أن قياس عدد الخلايا الدموية قد أُجري مرة واحدة فقط لكل عينة. يقوم جهاز Scepter بإجراء القياسات بناءً على حجم الخلية؛ وبناءً على ذلك، يمكن رصد أي تغييرات في المورفولوجيا الخلوية في المدرج التكراري.

تظهر المزارع الصحية توزيعًا غاوسيًا (Gaussian distribution) جرسياً مثالياً، بينما تموت الخلايا غير الصحية وتسبب إزاحة في المدرج التكراري نحو اليسار. وبالمثل، عند خلط مجموعة مكونة من 50% من الخلايا الميتة مع 50% من الخلايا الحية، لوحظت أيضاً إزاحات في المدرج التكراري. لقد أوضحت لكم للتو كيفية استخدام عداد الخلايا Scepter الجديد من Millipore، والذي يحدث ثورة في الطريقة التي يقوم بها الباحثون بعدّ خلاياهم.