عد الخلايا الجذعية العصبية البشرية
أغسطس 22, 2007
مطلوب معرفة العدد الدقيق للخلايا قابلة للحياة لكثير من التلاعب زراعة الأنسجة. هذا البروتوكول يصف كيفية التفريق بين الخلايا الحية والميتة وتحديد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. على الرغم من أنه يصف العد الجذعية العصبية البشرية / السلائف الخلايا (hNSPCs) ، ويمكن استخدامه لأنواع الخلايا الأخرى.
سأوضح لكم الآن كيفية عد الخلايا السلفية العصبية البشرية، حيث يتم عد الخلايا عندما ترغبون في تحضيرها للكيمياء المناعية أو عند الرغبة في إجراء عملية ترنسفكشن باستخدام العامل النووي. أستخدم في ذلك مقياس خلايا (hemocytometer) بتباين طوري يحتوي على شبكة حواف، كما نستخدم صبغة تسمى tripan blue. وتكمن فائدة هذه الصبغة في قدرتها على التمييز بين الخلايا الحية والميتة.
تمتص الخلايا الميتة أو المحتضرة هذه الصبغة وتظهر باللون الأزرق. وعند فحص الخلايا في مقياس كرات الدم (hemocytometer)، تكون الخلايا الحية قادرة على استبعاد هذه الصبغة وبالتالي لا تظهر باللون الأزرق. وبهذه الطريقة، يمكنك تحديد حيوية خلاياك عن طريق تحضير محلول من صبغة trypan blue والوسط الزرعي.
سأضيف 20 µL من محلول trap and blue إلى أنبوب epi سعة 0.5 mil هذا. ثم سأضيف 25 µL من الوسط الغذائي. وبذلك يكون لدي الآن 45 µL من محلول trap pan blue والوسط الغذائي، بحيث عندما أضيف 5 µL من معلق الخلايا، سأحصل على تخفيف بنسبة 1 إلى 10.
والآن، سأقوم بإضافة 5 µL من معلق الخلايا. أولاً، سأتأكد من إعادة تعليق الخلايا جيداً عن طريق الرج بالأصابع (finger vortexing). لذا، أريد الآن التأكد من أن هذا المحلول مختلط جيداً.
لذا، سأقوم بتحريك المنصة للأعلى والأسفل بضع مرات. وأخيراً، سأقوم بتحميل حوالي 12 µL من معلق الخلايا هذا في مقياس كرات الدم (hemocytometer). وهو يحتوي على منفذين، ويمكنك استخدام أي منهما.
لذا، كل ما عليك فعله هو إدخال المحلول عند هذا المنفذ، وسوف يتم سحب السائل عن طريق الخاصية الشعرية. والآن أنا مستعد للعد. إليكم نظرة على مقياس كرات الدم (hemo cytometer) بتكبير 10x، وهنا لدينا ربع يحتوي على 16 مربعاً.
وكما ترون، يمكننا ملاحظة الخلايا الحية والميتة هنا. لدينا هنا خلايا حية مثل هذه وهذه وهذه. كما لدينا أيضاً بعض الخلايا الميتة مثل هذه الخلية.
كما تلاحظون، تظهر الخلية الميتة باللون الأزرق الداكن، بينما تحاط الخلايا الحية بما يشبه الهالة حولها. لذا سأقوم الآن بعدّ جميع الخلايا الحية، وسأبدأ من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل.
1، 2، 3، 4، 5، 6، 33، 1 32، 33، 34، 3 5، 3 6. وبذلك يكون لدينا إجمالي ست وثلاثون خلية في هذا الربع. لذا، عندما أرى خلايا تقع على حدود الربع، كما هو الحال على طول هذا الخط هنا، ومن أجل الاتساق، أقوم بعدّ الخلايا الموجودة على الحدود اليسرى والحدود العلوية.
وأقوم باستمرار بعدّ الخلايا الموجودة على تلك الحدود لجميع الأرباع في مقياس كرات الدم. والآن سنقوم بحساب عدد الخلايا لكل ميكرولتر. وللقيام بذلك، سآخذ متوسط عدد الخلايا لكل ربع، وهو 38، وأضربه في 10، وهو عامل يتم تحديده بناءً على أبعاد الغرفة.
وسنقوم أيضاً بالضرب في 10، وهو معامل التخفيف في هذه الحالة. وفي النهاية، سنحصل على عدد الخلايا لكل ميكروليتر. لذا، لدينا في هذه الحالة 3,800 خلية لكل µL.
وبما أننا أعدنا تعليق كتلة الخلايا في 500 µL من المحلول، يمكنك حساب العدد الإجمالي للخلايا لديك. وبذلك نكون قد انتهينا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لعد الخلايا الجذعية/السليفة العصبية البشرية (hNSPCs) باستخدام مقياس كرات الدم (hemacytometer). وهو يؤكد على أهمية التمييز بين الخلايا الحية والميتة لمختلف تطبيقات زراعة الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- زراعة الأنسجة
خلفية علمية
- يعد عدد الخلايا الحية أمراً بالغ الأهمية في عمليات زراعة الأنسجة.
- تستطيع الخلايا الحية استبعاد بعض الأصباغ، بينما لا تستطيع الخلايا الميتة ذلك.
- يعتبر مقياس كرات الدم (Hemacytometer) أداة قياسية لعد الخلايا.
- يُستخدم صبغ Trippan blue بشكل شائع لتقييم حيوية الخلايا.
الغرض من الدراسة
- لتوفير طريقة موثوقة لعد الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSPCs).
- للتمييز بفعالية بين الخلايا الحية والميتة.
- لمساعدة الباحثين في التحضير لتجارب إضافية مثل الكيمياء النسيجية المناعية أو عفن الخلايا (transfection).
الطرق المستخدمة
- استخدام مقياس كرات الدم (hemacytometer) بتباين الطور.
- تطبيق صبغة Trippan blue للتمييز بين الخلايا الحية والميتة.
- عد الخلايا تحت المجهر.
- تحضير محلول من صبغة Trippan blue والوسط الزرعي.
النتائج الرئيسية
- التمييز الناجح بين الخلايا الحية والميتة.
- التقدير الكمي الدقيق لـ hNSPCs.
- إثبات فعالية صبغة Trippan blue.
- التحقق من كفاءة مقياس كرات الدم (hemacytometer) كطريقة عد موثوقة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول نهجاً مباشراً لعد الخلايا.
- يمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا بخلاف hNSPCs.
- يعد فهم حيوية الخلايا أمراً أساسياً لنجاح تجارب زراعة الأنسجة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد التحديد الكمي الدقيق للخلايا الجذعية/السليفة العصبية البشرية (hNSPCs) القابلة للحياة أمراً ضرورياً لضمان قابلية تكرار سير عمل زراعة الأنسجة في مجال اكتشاف الأدوية العصبية. يتيح هذا البروتوكول تقييماً موثوقاً لحيوية الخلايا وقياساً دقيقاً لتركيزها، مما يدعم عملية استزراع الخلايا بشكل متسق للتطبيقات اللاحقة مثل الكيمياء النسيجية المناعية والترانسفكشن (transfection). ومن خلال توحيد معايير التمييز بين الخلايا الحية والميتة باستخدام صبغة Trypan blue والعد القائم على مقياس كرات الدم (hemacytometer)، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في مراحل التحقق الأولية من الأهداف ومسارات تطوير المقايسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استزراع الخلايا السلفية العصبية البشرية (hNSPCs) بدقة لدراسات الارتباط بالهدف وتعديل المسارات.
- القيمة التشغيلية: تقلل من التباين في المقاييس المعتمدة على الخلايا من خلال ضمان إدخال ثابت للخلايا الحية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفر بيانات كمية وقابلة للتكرار عن تركيز الخلايا، وهي بيانات بالغة الأهمية لتوحيد المقايسات.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحضير القابل للتوسع لمعلقات الخلايا لتناسب تنسيقات الفحص عالي المحتوى.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحافظ على اتساق المدخلات الخلوية عبر مراحل الانتقال من مرحلة الاكتشاف إلى المراحل قبل السريرية.
- القيمة التشغيلية: يسهل التعاون بين الوظائف المختلفة من خلال ممارسات قياسية لعد الخلايا.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشافات المبكرة، حيث تدعم التحضير الموثوق للخلايا بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المقايسة واختبار الفعالية قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تضمن دقة جرعات الخلايا لتجارب التحقق من الأهداف التي تتضمن hNSPCs.
- الفحص: توفر مدخلات خلوية معيارية وقابلة للقياس الكمي، وهي ضرورية لأداء المقايسات القابلة للتكرار.
- التحليلات: تُنتج مخرجات لتركيز الخلايا الحية والعدد الإجمالي المستخدمة لتوحيد الظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تدعم الاستمرارية في التعامل مع الخلايا بين مرحلة الاكتشاف في المختبر والنماذج قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تمثل قدرة قابلة للنقل ومنخفضة التعقيد يمكن تطبيقها عبر أنواع متعددة من الخلايا والمشاريع.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تحسين الثقة التنبؤية من خلال تقليل التباين في المدخلات التجريبية القائمة على الخلايا.
- القيمة التشغيلية: تعزيز إمكانية التكرار والتوحيد القياسي عبر المختبرات والفرق المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: دعم اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف من خلال أسس موثوقة للمقايسات.
- التأثير على مجموعة المشاريع: تمكين التقدم المعدل وفقاً للمخاطر من خلال ضمان جودة البيانات في عمليات فحص الفعالية الأولية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب إتقان تقنيات زراعة الأنسجة الأساسية والفحص المجهري.
- يعتمد على توفر مقياس كرات الدم (hemacytometer) والتنظيف الصحيح لتجنب التلوث.
- يستلزم تدريبًا مستمرًا للمشغل لضمان اختيار المربعات دون تحيز واتباع قواعد عد الحدود.
- يقتصر بقدرة العد اليدوي؛ وهو غير مناسب للأتمتة عالية الإنتاجية دون إجراء تعديلات.
- يعتمد على التخفيف والخلط الصحيحين لضمان أخذ عينات ممثلة لمعلق الخلايا.
