تصور الوسطيات المتماثل للأشعة فوق البنفسجية يتسبب في E. القولونية ثنائي الأبعاد باستخدام Agarose جل التحليل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الوسائط الهيكلية للحمض النووي DNA التي تظهر عندما يواجه التضاعف آفات في الحمض النووي DNA باستخدام تحليل الهلام ثنائي الأبعاد. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الحمض النووي DNA من خلايا تنقسم بنشاط والتي تم تحفيز آفات حجب التضاعف فيها، ثم يُستخدم الرحلان الكهربائي للهلام لفصل الحمض النووي DNA المستخلص بناءً على الحجم.

بعد ذلك، يتم قص المسارات وإعادة صبها أفقيًا في هلام ثانٍ يعمل على فصل DNA بشكل إضافي بناءً على الحجم والشكل معًا. وأخيرًا، يُستخدم تحليل Southern لتصور هياكل DNA المرتبطة بقطع DNA المتضاعفة في أوقات تسبق وبأوقات مختلفة تلي إحداث الضرر الناجم عن UV. وفي النهاية، يمكن استخدام هذا الإجراء لإظهار أن عدم القدرة على معالجة آفات DNA في بعض الطفرات يؤدي إلى تراكم وسائط إصلاح DNA.

مرحباً، اسمي آرثر إيان. أنا من مختبر Corella في جامعة Portland State. مرحباً، اسمي براند شي، وأنا أيضاً من مختبر Corella.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للترحيل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة وسائط تكرار DNA وإصلاحه. لذا، دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء، يتم استنبات مزرعة ليلية بحجم 200 µL من بكتيريا e coli التي تحتوي على البلازميد PBR 3 22 في وسط DGC thigh المضاف إليه الأمبيسيلين عند درجة حرارة 37 °C. إن استخدام وسط DGC thigh يقلل من حجب الأشعة فوق البنفسجية. بعد الحضن الليلي، يتم تجميع الخلايا في كريّة عن طريق الطرد المركزي بسرعة 14,000 RRP M لمدة 30 ثانية.

ثم أعد تعليق كتلة الخلايا في 200 µL من وسط DG C th الخالي من الأمبيسيلين وقم بالتلقيح. قم بنمو المزارع في 20 mL من وسط DG C thigh دون اختيار بالأمبيسيلين، وذلك في حاضنة هزازة عند 37 °C حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.5، وهو ما يعادل حوالي 5 × 10⁸ خلية لكل ملليلتر؛ حيث يهدف النمو بدون الأمبيسيلين إلى تجنب الانتقاء ضد وسائط التضاعف غير الطبيعية أو غير المنتجة التي قد تظهر في بعض الطفرات.

بالإضافة إلى ذلك، في حالة استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) لإحداث الضرر، يكون من الضروري إزالة الأمبيسيلين من الوسط الغذائي لأنه يمتص هذه الأطوال الموجية بقوة ويعمل كدرع، مما يقلل من الجرعة الفعالة من الأشعة فوق البنفسجية أثناء نمو الخلايا. استخدم مقياس ضوء UVC لتحديد المسافة من مصباح مبيد للجراثيم بقدرة 15 watt والتي تنتج معدل تعريض يبلغ تقريباً JUUL واحد لكل متر مربع لكل ثانية.

يجب تنفيذ الخطوات اللاحقة تحت ضوء أصفر، حيث إن ذلك سيمنع عكس التنشيط الضوئي لثنائيات سيكلوبوتان بيريميدين بواسطة فوتولياز بعد التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية. وبمجرد الوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة، استخدم ماصة لنقل المزرعة إلى طبق بتري بقطر 15 سنتيمتر على منصة دوارة لضمان توزيع التشعيع بالتساوي على كامل مجموعة الخلايا. بعد ذلك، قم بتشعيع المزارع بـ 50 joules per meter squared وانقلها فوراً إلى دورق معقم ومسخن مسبقاً، ثم أعدها إلى الحاضنة الهزازة عند 37 degrees Celsius.

خلال فترة التجربة، تنتج هذه الجرعة في المتوسط دايمر سيكلوبوتان بيريميدين واحد لكل 4.5 kilobases من DNA أحادي السلسلة لكل نقطة زمنية سيتم فحصها. انقل بواسطة الماصة 0.75 milliliter من المزرعة إلى 0.75 milliliters من Buffer net 30 المبرد بالثلج. يعمل Buffer net 30 كمنظم إيقاف يمنع استمرار عمليات التضاعف وإصلاح استئصال النوكليوتيدات.

بمجرد إضافة منظم الإيقاف، يمكن الاحتفاظ بالعينة على الثلج حتى نهاية المدى الزمني. بعد انتهاء المدى الزمني، قم بترسيب كل عينة ثم أعد تعليق الرواسب. وفي 150 µL من منظم التحلل، قم بتحليل الخلايا عند 37 °C لمدة 20 دقيقة دون رج.

نظرًا لأن التراكيب المتكررة ذات المناطق أحادية السلسلة أو نقاط التفرع تكون أكثر عرضة للقص، يجب قطع رؤوس الماصات باستخدام شفرة حلاقة لجعل الفتحة أوسع وتقليل قوى القص. وبشكل عام، يجب تقليل عمليات السحب بالماصة والرج إلى أدنى حد حتى يتم هضم الـ DNA باستخدام إنزيمات القطع، وبعد عملية التحلل، يتم إضافة proteinase K و sarcas cell وترك فترة التحضين تستمر لمدة ساعة واحدة. يعمل ذلك على تحرير قطع الـ DNA المرتبطة بالبروتين.

بما أن الحمض النووي DNA الذي يتضاعف بنشاط يكون غالبًا مرتبطًا بمعقدات بروتينية أو غشائية، فإن هذا يساعد في زيادة إنتاجية شظايا التضاعف. بعد مرور ساعة واحدة، استخلص العينات بإضافة حجمين من الفينول إلى كل عينة وقلب الأنابيب بلطف لمدة خمس دقائق. ثم أضف حجمين من الكلوروفورم وكحول الإيزواميل، وقلب الأنابيب بلطف لمدة خمس دقائق إضافية.

بعد ذلك، يتم طرد العينات مركزياً بسرعة 14,000 RPM في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة خمس دقائق، ثم تُنقل المرحلة المائية العلوية من كل عينة إلى أنبوب جديد. بعد ذلك، تُضاف أربعة أحجام من الكلوروفورم وكحول ISO، ثم تُقلب الأنابيب بلطف مرة أخرى لمدة خمس دقائق. تُطرد العينات مركزياً مرة أخرى بسرعة 14,000 RPM لمدة خمس دقائق.

ضع غشاء دياليز فوق 250 milliliters من 0.1 xte في دورق، ثم ضع 100 microliters من كل عينة على الغشاء. اترك العينات لتخضع للدياليز لمدة ساعة واحدة بعد بدء العملية. انقل 80 microliters من كل عينة إلى أنبوب 1.5 milliliter جديد يحتوي على 20 microliters من مزيج الإنزيم.

اترك العينات لتُهضم طوال الليل عند 37 درجة Celsius. يقوم إنزيم PV two بخطيّة البلازميد مباشرة بعد أصل التضاعف. وقبل تحميل هلام الأجاروز، أضف 100 microliters من الكلوروفورم و 20 microliters من صبغة التحميل بتركيز six x التي تحتوي على البروموفينول الأزرق.

أضف الفينول الأزرق والزيليلين السيان إلى كل عينة واخلطها، حيث سيعمل الكلوروفورم على إزالة أي PV two متبقٍ مرتبط بنهايات DNA. ابدأ تحليل هلام الأجاروز ثنائي الأبعاد عن طريق تشغيل عينات DNA المقطوعة عبر البعد الأول. أولاً، قم بتحميل علامة حجم Lambda hind three في المسار الأول من هلام أجاروز بتركيز 0.4% تم تحضيره مسبقاً في 1XTBE.

ثم يتم تحميل 40 µL من الطور المائي الذي يحتوي على صبغة التحميل لكل عينة، مع ترك ممرات فارغة لتسهيل عملية تقطيع الهلام. بعد عملية الرحلان الكهربائي، يتم تشغيل البعد الأول بجهد فولت واحد لكل سنتيمتر لمدة تتراوح تقريباً بين 12 إلى 15 ساعة. يعمل الجهد المنخفض وهلام AGROS ذو النسبة المئوية المنخفضة على فصل قطع DNA بناءً على الحجم بشكل أساسي.

بعد انتهاء البعد الأول، استخدم سكين جزار كبيرة لقص المسار الأول الذي يحتوي على واسم Lambda hind three وقم بالصبغ باستخدام بروميد الإيثيديوم. وبالنسبة للبعد الثاني، قم بتقطيع مسارات الهلام باستخدام سكين الجزار الكبيرة مع استخدام واسم Lambda Hind three كدليل، ثم قم بقص واستبعاد المنطقة الموجودة أسفل المكان المتوقع لهجرة البلازميد الخطي في كل مسار. لصب البعد الثاني، ضع كل شريحة أفقيًا عبر الجزء العلوي من صبّابة هلام فارغة.

قم بتحضير محلول من 1%AROS في XTBE واحد وبرّده حتى 55 درجة مئوية. وبمجرد التبريد، صب محلول الهلام لصب البعد الثاني، مع التأكد من تغطية شرائح الهلام بالكامل. من المهم التأكد من توجيه الشرائح بشكل متساوٍ واستواء القالب قبل صب الهلام.

بمجرد أن يتصلب الهلام، يتم تشغيل البعد الثاني لمدة تتراوح بين خمس ساعات ونصف إلى سبع ساعات بجهد 6.5 vols لكل سنتيمتر في وحدة ترحيل كهربائي تسمح بإعادة تدوير المنظم؛ حيث يقوم الجهد العالي وهلام Agros ذو النسبة المئوية العالية بفصل قطع DNA بفعالية بناءً على شكلها وحجمها. وتتحرك الأشكال غير الخطية ببطء أكبر خلال البعد الثاني بعد الترحيل الكهربائي. اشطف الهلام بالماء مرة واحدة، ثم اغسله مرتين في 400 milliliters من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.25 molar لمدة 15 minutes مع التحريك اللطيف.

تُستخدم عمليات الغسل الحمضية لعمل شقوق جزئية في جزيئات DNA لتحويلها إلى قطع أصغر تنتقل بكفاءة أكبر أثناء تحليل Southern، وهي ضرورية نظرًا للحجم الكبير والشكل غير المعتاد لوسائط تضاعف DNA. ولتحضير الهلام للنقل القلوي، اشطف الهلام مرة أخرى بالماء، ثم اغسله مرتين في 400 milliliters من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.4 molar لمدة 30 minutes. بعد ذلك، يتم نقل DNA الموجود في الهلام إلى غشاء nylon من نوع high bond n plus باستخدام نظام نقل قلوي هابط مع هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.4 molar كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا الإجراء؛ اترك DNA ينتقل لمدة تتراوح من ست إلى 12 hours، ثم تابع بعد نقل DNA بعملية تهجين المسبار كما هو مبين في البروتوكول المكتوب.

بمجرد فحص الغشاء وغسله، ضع الغشاء على مناديل ورقية حتى يختفي السائل تماماً. ثم قم بلف الغشاء بغشاء بلاستيكي من بولي كلوريد الفينيل وعرضه على شاشة التصوير الفسفوري. وأخيراً، يمكن تصور النشاط الإشعاعي وقياسه كمياً باستخدام جهاز storm eight 40 وبرنامج image quant المرتبط به.

يوضح المخطط نمط هجرة البلازميد PBR 3 22 المهضوم بواسطة PV two كما لوحظ من خلال تحليل هلام الأجار ثنائي الأبعاد (2D agarose gel analysis). تهاجر البلازميدات الخطية غير المتضاعفة كقطع خطية بحجم 4.4 KB، بينما تشكل البلازميدات المتضاعفة هياكل على شكل حرف Y تهاجر بشكل أبطأ من القطع غير المتضاعفة نظراً لحجمها الأكبر وشكلها غير الخطي. يشكل نمط الهجرة هذا قوساً يمتد من المنطقة الخطية باتجاه البئر بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV irradiation).

تُلاحظ جزيئات على شكل Y مزدوجة أو على شكل X في منطقة المخروط، وتهاجر ببطء أكبر من قوس الجزيئات التي تتخذ شكل Y. يوضح المثال التالي التحليل الجنوبي لهلام ثنائي الأبعاد تم فحصه باستخدام PBR 3 22 المسمى بـ P 32، وذلك للخلايا فور تعريضها للإشعاع فوق البنفسجي وبعد 15 دقيقة من التعرض للإشعاع فوق البنفسجي. ويمكن العثور على ما يقرب من 1% من إجمالي الحمض النووي للبلازميد في قوس Y عندما تنمو الخلايا بسرعة في المرحلة الأسية التي تلي الإشعاع.

يُلاحظ حدوث زيادة عابرة في الجزيئات التي تتخذ شكل YS مع تراكم شوكات التضاعف المتوقفة عند المواقع المتضررة. كما تتراكم وسيطات التضاعف التي تتخذ شكل L بشكل عابر وتستمر حتى الوقت الذي يتزامن مع إصلاح الآفات. لقد عرضنا لك للتو كيفية تصور وسيطات إصلاح DNA باستخدام الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الانتباه إلى قوى القص التي يمكن أن تقلل من الحصيلة، والتعامل برفق مع جميع العينات والهلامات. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.