يعاير β اميلويد السمية باستخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس النموذجي

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس سمية ببتيد بيتا أميلويد في نموذج نظام حي (InVivo). وتسمح إمكانية تكرار هذا المقايسة وبساطتها النسبية بالاختبار السريع للأدوية، أو الظروف البيئية، أو التعديلات الجينية على سمية بيتا أميلويد. ويتمثل العامل الرئيسي في تطوير هذه المقايسة في إنتاج ديدان *C. elegans* معدلة وراثياً، بحيث يكون التعبير عن ببتيد بيتا أميلويد محفزاً بالحرارة ومحددًا في العضلات.

يتم هندسة هذا التعبير الحساس لدرجة الحرارة من خلال بناء جين منتقل يحتوي على منطقة غير مترجمة ثلاثية prime طويلة بشكل غير طبيعي، مما يجعل mRNA الجين المنقول هدفاً لنظام مراقبة mRNA؛ وبناءً على ذلك، يكون التعبير عن هذا الجين المنقول ضعيفاً في الديدان من النوع البري التي تمتلك نظام مراقبة mRNA فعالاً بسبب تحلل mRNA الجين المنقول. وإذا تم إدخال هذا الجين المنقول في خلفية وراثية تحتوي على طفرة في مكون أساسي من نظام مراقبة mRNA، فسيكون التعبير عن الجين المنقول أعلى بكثير. أما إذا كانت الخلفية الوراثية تحتوي على طفرة حساسة لدرجة الحرارة في نظام مراقبة mRNA، فإن إكثار هذه السلالة المعدلة وراثياً عند درجة الحرارة غير المسموح بها سيؤدي إلى منع تحلل mRNA الجين المنقول وينتج عنه تعبير عالٍ للجين المنقول. وتستخدم الديدان المعدلة وراثياً هذا النظام لتنظيم تعبير ببتيد beta amyloid في عضلات جدار الجسم، حيث يؤدي رفع درجة الحرارة من 16 °C إلى 25 °C إلى تراكم عالٍ لببتيد beta amyloid، مما يسبب خللاً وظيفياً في الخلايا العضلية وشللاً في الديدان، ويتم قياس الوقت.

تستغرق مجموعة من هذه الديدان المعدلة وراثياً وقتاً لتصاب بالشلل بعد رفع درجة الحرارة. ويُعد هذا الفحص اختباراً حساساً لسمية бета amyloid. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير أطباق وسط نمو النيماتودا الطازجة لاختبار الشلل، مما يساعد في تقليل المتغيرات البيئية التي يمكن أن تؤثر على معدلات الشلل.

كخطوة ثانية، يتم بدء مجموعات متزامنة عمرياً من الديدان المعدلة وراثياً، مما يقلل من تأثيرات المرحلة التنموية على تعبير الجين المنقول. بعد ذلك، يتم نقل الديدان المتزامنة في المرحلة اليرقية الثالثة من 16 درجة Celsius إلى 25 درجة Celsius، مما يزيد من استقرار mRNA للجين المنقول ويؤدي إلى تراكم ببتيد بيتا أميلويد. إن قياس الوقت من لحظة رفع درجة الحرارة حتى حدوث الشلل لكل دودة يحدد معدل خلل وظائف العضلات، وبالتالي يتم تقييم الآثار السامة لتراكم ببتيد بيتا أميلويد؛ وبذلك يتم الحصول على نتائج توضح تأثير علاجات محددة على سمية ببتيد بيتا أميلويد الذي يتم التعبير عنه داخلياً.

لذا، تكمن الميزة الرئيسية لتقنيتنا، مقارنة باستخدام نماذج الفئران المعدلة وراثياً لتقييم نشاط الدواء، في أننا نستطيع تنفيذ تقنيتنا بسرعة أكبر وب تكلفة أقل بكثير. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية؛ إذ إن تسجيل درجات ديدان في المرحلة L4 في اختبار الشلل يعد أمراً صعب التعلم للغاية.

لذا، عند تقييم دودة في المرحلة L4 مصابة بالشلل، يجب مراقبة حركة الهالة المنعزلة لمنطقة الرأس في الدودة. وبمجرد أن يتحرك الرأس بينما يكون جسم الدودة بالكامل مشلولاً، يتم تصنيف تلك الدودة على أنها مصابة بالشلل. تُجرى مقايسات الشلل على أطباق تحتوي على وسط نمو النيماتودا القياسي (NGM) المستخدم بشكل روتيني لإكثار ودراسات وراثة *C. elegans*.

لتحضير الأطباق، قم بتعقيم محلول NGM الذي يحتوي على كلوريد الصوديوم والآجار والببتيد باستخدام الموصدة (autoclave) في دورق إرلنماير، ثم أضف الكميات المناسبة من المحاليل المعقمة التالية الموضحة في البروتوكول المكتوب المرفق. وزّع 10 milliliters من محلول NGM السائل في كل طبق بتري مقاس 60 millimeter في 15 millimeter. اترك محلول NGM ليتجمد طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في حالة اختبار تأثيرات المركبات أو المستخلصات، قم بتقسيم المستخلص إلى حصص متساوية على كل طبق، واستخدم ناشراً لتوزيعه بالتساوي على سطح الطبق. اترك الأطباق لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. ستتطلب الأحجام التي تتجاوز 1 ml وقتاً أطول للجفاف.

بعد ذلك، يتم وضع 250 µL من سلالة e coli OP 50 المنماة في وسط LB طوال الليل حتى تصل الكثافة الضوئية إلى 0.4 إلى 0.6 على كل طبق، ثم تُترك البكتيريا لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. يؤثر عمر الطبق بشكل كبير على معدل الشلل، وبناءً على ذلك، تميل الأطباق القديمة إلى الجفاف. لذا يجب صب الأطباق خلال أسبوع واحد من إجراء اختبار الشلل.

من الناحية المثالية، يُفضل استخدام أطباق تم صبّها قبل ثلاثة إلى أربعة أيام من عملية وضع البيض المتزامن؛ كما يجب أن تكون جميع الأطباق المستخدمة في أي تجربة من الدفعة نفسها، لأن تغيير حجم المستعمرة البكتيرية و/أو نوع البكتيريا سيؤدي أيضاً إلى تغيير سلوك الديدان. يمكن إجراء مقايسات الشلل باستخدام سلالات بديلة من بكتيريا e coli، فعلى سبيل المثال، تُستخدم سلالة HT115 في تجارب RNAi، ومع ذلك، قد يؤدي ذلك إلى تغيير حركية مقايسة الشلل.

لذلك، يجب عليك استخدام ضوابط داخلية ملائمة للسلالة. تُستخدم السلالة CL 476 بشكل شائع لتقييم الشلل المستحث بواسطة beta. تتوفر هذه السلالة ونماذج أخرى معدلة وراثياً للباحثين الأكاديميين مقابل رسوم رمزية من مركز Saint Ahadi Genetic Center.

لتحقيق أقصى قدر من التزامن العمري لمجتمع الاختبار، يُفضل البدء بجيل أبوي متزامن. وقبل أسبوع من بدء مقايسة الشلل لمجتمع الاختبار، استخدم ملتقط ديدان بلاتينيًا لنقل 20 إلى 30 من البالغين الحوامل إلى عدة أطباق NGM بقطر 10 سنتيمتر.

يتم التوزيع مع OP 50 لمدة ساعتين لوضع البيض عند 16 درجة مئوية، وهي درجة الحرارة المسموح بها لـ CL 4 1 76. يتم إزالة البالغين من GR والسماح للنسل بالنمو لمدة سبعة أيام، وبحلول ذلك الوقت سيكونون بالغين في اليوم الثاني من مرحلة الجاذبية. اليوم الثاني من الجاذبية.

تُستخدم الديدان البالغة لتحضير مجموعات اختبار متزامنة العمر لكل حالة تجريبية. والهدف من ذلك هو إنشاء أطباق ثلاثية مكررة تحتوي على 50 إلى 75 دودة متزامنة العمر باستخدام ملتقط ديدان بلاتيني. يتم نقل 10 إلى 12 دودة بالغة في اليوم الثاني من مرحلة البلوغ إلى أطباق NGM بقطر 60 مليمتر مرقطة بسلالة OP 50. تُترك الديدان لوضع البيض عند درجة حرارة 16 °C لمدة ساعتين، ثم تُزال الديدان البالغة ويُترك البيض ليفقس وينمو عند درجة حرارة 16 °C.

في هذه المرحلة، يفضل أن يقوم شخص لن يشارك في تقييم الأطباق بترقيمها، وذلك لضمان إجراء التقييم بشكل تعمية عن الظروف التجريبية. وتعتبر مرحلة التطور الجنيني عند وضع البيض، والتي تكون تقريبًا في مرحلة 26 خلية للديدان من النوع البري (wild type) في الظروف المثالية، دالة على عمر البالغين وتغذيتهم. فإذا كانت الديدان البالغة المستخدمة لوضع البيض أكبر سنًا أو تعاني من التجويع، فسيتم وضع بيض في مراحل تطور متأخرة، وبالتالي لن يتم تحقيق مجتمع متزامن، مما يؤثر على حركية مقايسة الشلل.

من الضروري استخدام مستنبتات بكتيرية أحادية الجين مثل e coli, OP 50 لأن التلوث البكتيري من أي نوع يمكن أن يؤثر بشكل كبير على هذا المقايسة. تكون إمكانية التكرار في أعلى مستوياتها إذا كانت الأطباق الثلاثية تحتوي على عدد مماثل من الديدان. لتحفيز الجين المنقول وإجراء مقايسة الشلل، يتم رفع درجة حرارة الأطباق إلى 25 degrees Celsius.

بعد مرور 48 ساعة من نهاية وضع البيض المتزامن، يجب أن تكون الديدان في المرحلة اليرقية الثالثة. يجب ترتيب الأطباق دون تكديس في حضانة بدرجة حرارة 25 degree Celsius للسماح للأطباق بالوصول إلى هذه الدرجة. وفي الوقت نفسه، ابدأ بتقييم شلل الديدان بعد مرور 18 إلى 20 ساعة من بدء عملية الرفع الحراري.

في هذه المرحلة، يجب أن تكون جميع الديدان في المجموعة قد وصلت إلى المرحلة اليرقية الرابعة، استمر في تسجيل النتائج بزيادات زمنية قدرها ساعتان حتى تصاب جميع الديدان في كل طبق بالشلل. لأسباب غير معروفة، لا يكون الشلل متساوياً على طول الجسم، حيث تكون منطقة الرأس هي آخر جزء يتوقف عن الحركة في الدودة.

وبناءً على ذلك، فإن الديدان التي بدأت للتو في حالة الشلل لا تستطيع الانتقال عبر الطبق، ولكن يمكنها تحريك رؤوسها، مما يؤدي إلى إزالة البكتيريا حول منطقتها الأمامية وترك هالة من البكتيريا المزالة. هذه الديدان ستصاب حتماً بشلل تام، وبالتالي تُصنف الديدان التي تظهر حولها هالات على أنها مشلولة. كما أن بعض الديدان لن تظهر حولها هالات، ولكنها لن تظهر أيضاً أي حركة تلقائية.

يتم اختبار هذه الديدان عن طريق وخزها باستخدام أداة التقاط الديدان. وإذا لم تتمكن الدودة الموخوزة من إجراء انتشار للموجة في كامل الجسم عند الوخز، يتم تسجيلها أيضاً على أنها مشلولة لضمان كفاءة عملية التسجيل. ومن الأسهل نقل الديدان المشلولة إلى قطاع غير محدد بعلامات في الطبق حتى لا يتم إعادة تسجيلها عن غير قصد في فترة التسجيل التالية.

يسمح هذا أيضاً للديدان التي صُنفت بشكل خاطئ بإظهار الحركة، مما يتيح تصحيح الدرجات لإنشاء منحنى شلل. عند كل نقطة زمنية، يتم تحويل جزء الديدان في كل طبق التي لم تصب بالشلل إلى نسبة مئوية، ويتم رسم متوسط النسبة المئوية غير المشلولة مقابل الوقت بدءاً من لحظة بدء الرفع الحراري. يكون المنحنى الناتج مماثلاً من الناحية الرسمية لمنحنى البقاء، وبالتالي يمكن تحليله باستخدام إحصاءات البقاء غير المعلمية القياسية.

يجب إجراء نقل الديدان المعدلة وراثياً التي تحمل Myo-3-Aβ إلى مرحلة أعلى بحلول منتصف مرحلة L4 من أجل بدء حدوث الشلل. يخضع محفز Myo-3 لتنظيم نمائي، وبمجرد وصول الديدان إلى مرحلة L4 المتأخرة أو مرحلة البلوغ، ينخفض مستوى التعبير بشكل ملحوظ.

يتم حظر تعبير الجين المنقول إذا تعرضت الديدان للتجويع، لذا فمن الضروري جداً أن تتغذى الديدان جيداً طوال فترة التجربة. لم نلاحظ أبداً تعافي دودة مصابة بالشلل تحت أي ظرف. بعد 12 إلى 16 ساعة من رفع درجة الحرارة (Upshift)، ستصاب ديدان السلالة CL 41 76 بالشلل، بغض النظر عما إذا كنت قد خفضت درجة حرارتها إلى 16 درجة؛ ففي السلالة CL 41 76، يمكن أن يحدث التنظيم التصاعدي لتعبير الجين المنقول الذي يسبب الشلل في درجات حرارة أقل.

ومع ذلك، يرجى ملاحظة أن توقيت معدل الشلل سيتأثر؛ حيث يعتمد معدل الشلل على سلالة transgene المحددة المستخدمة. لقد قمنا بإنشاء ثلاث سلالات من myo A beta تتميز بمعدل شلل أسرع وأبطأ من سلالة CL 41 76، وبناءً على ذلك، يتعين عليك ضبط نافذة التقييم الخاصة بمقايسة الشلل وفقاً لذلك.

يظهر هنا رسم بياني لمنحنى الشلل للسلالة CL 4 1 76، في كل من الحالة غير المعالجة والحالة المعرضة لـ 6.27 millimolar من الكافيين. تؤدي هذه المعالجة إلى تأخير ذي دلالة إحصائية عالية في حدوث الشلل لمدة أربع ساعات تقريبًا، وهو ما نفسره على أنه مؤشر على تثبيط سمية beta. وقد تم في هذا النموذج من التجربة تقييم آثار مركب آخر موجود في القهوة.

يعتبر المخطط البياني نموذجياً للمعالجات التي لا تؤثر على السمية من النوع بيتا. لاحظ أنه في كلتا التجربتين، أصيب حوالي نصف مجتمعات CL 4 1 76 غير المعالجة بالشلل عند 24 ساعة، وكان الشلل تاماً بحلول 28 ساعة. وتعد هذه الأطر الزمنية نموذجية للشلل في مجموعة الضبط.

تعتبر الانحرافات الملحوظة في هذا التوقيت لدى مجموعات CL 4 1 7 6 مؤشراً على تغير الظروف البيئية أو الحذف التلقائي لنسخ الجين المنقول. راجع البروتوكول المرفق للحصول على معلومات إضافية حول السلالة CL 4 1 76. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراعاة عمر الأطباق، ومرحلة نمو مجموعة الديدان، والقدرة على تقييم معدل الشلل لدى الديدان.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية استخدام نظام drosophila هذا لتقدير سمية бета amyloid بدقة. يجب أن تكون قادراً على اكتشاف تأثيرات دقيقة للغاية على هذه السمية ناتجة عن مجموعة متنوعة من العلاجات الدوائية أو البيئية. إن المتغيرات التي ناقشناها مهمة للغاية للاهتمام بها لأن ذلك سيمكنك من إجراء المقايسة بقابلية تكرار عالية ومع حركية شلل متسقة.

يعد هذا الأمر مهماً للغاية إذا كنت ترغب في مقارنة نتائجك التي أجريتها في مختبرك في أوقات مختلفة من قبل أشخاص مختلفين، أو مقارنة نتائجك مع باحثين آخرين يستخدمون نظام النموذج هذا.