الآلي الكمي من الإسفار متشابك في

الهدف من هذا الإجراء هو التحديد الكمي الفعال لأبعاد وسطوع الإشارات الفلورية النقطية في gans. وبذلك يمكن تحليل مجموعات كبيرة من الأجسام. يتم تصوير البروتينات المشبكية إحصائياً.

في هذا العرض التوضيحي، تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في توليد مستنبتات متزامنة عالية الكثافة من سلالات ELEGANS محل الدراسة. بعد ذلك، يتم الحصول على صور مجهرية بؤرية (confocal images) للمشابك العصبية الموصومة، مع تقليل التباين الفردي في الصور. ويتم تحديد الثقوب المشبكية تلقائياً وتمييزها عن الفلورة الخلفية.

تتمثل الخطوة النهائية في جدولة البيانات وتنظيمها لضمان كفاءة التحليل اللاحق. وفي نهاية المطاف، يمكن للنتائج أن توضح بدقة كيفية تأثير الظروف التجريبية على توزيع البروتينات المشبكية أو أي بروتين آخر يتمركز في نقاط تباين عالية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليل إسقاطات Zack، في الحفاظ على جميع البيانات، بما في ذلك أحجام المشابك العصبية، كما يتيح التعرف الآلي تجميع مئات العينات لكل حالة تم اختبارها بسرعة.

يتطلب هذا البروتوكول مزارع عالية الكثافة من ديدان CL egan's البالغة التي نمت في أطباق أغار NGM ذات الببتيد العالي بسماكة 10 سنتيمتر على بكتيريا NA 22 e Coli؛ جهّز طبقاً واحداً بدقة لكل صبغة مناعية مخطط لها. ابدأ بحصاد الديدان باستخدام بضع مليلترات من الماء، ثم انقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وكرر هذه العملية حتى يتم جمع معظم الديدان.

قم بترسيب الديدان واغسل الراسب بالماء حتى ثلاث مرات حتى يصبح السائل الطافي رائقاً. يؤدي ذلك إلى إزالة البكتيريا المتبقية. انقل دائماً المحاليل التي قد تحتوي أو تحتوي بالفعل على ديدان أو بيوض باستخدام ماصات بلاستيكية لأنها قد تلتصق بالزجاج. من الضروري الآن المضي قدماً بسرعة في الخطوات المتبقية لمنع فقدان حيوية البيوض.

قم بتحرير بيوض الديدان عن طريق إعادة ثنيها في خمسة ملليلترات 5 mL من محلول هيبوكلوريت القلوي. قم برج الأنابيب بلطف وفحصها تحت مجهر تشريحي مرة واحدة كل دقيقة تقريباً. كرر ذلك لمدة خمس دقائق، أو بمجرد أن تظهر حوالي نصف الديدان في الأنبوب مثنية ومفتوحة.

املأ الأنبوب حتى الأعلى بمحلول منظم للبيض (egg buffer) واقلبه عدة مرات. بعد ترسيب الديدان الحية، اسحب السائل الطافي وتخلص منه. ثم اغسل الراسب ثلاث مرات باستخدام محلول منظم للبيض (egg buffer).

بعد عمليات الغسل، يقوم ريس بتعليق الراسب في خمسة ملليلتر من الماء، يليه إضافة خمسة ملليلتر من محلول السكروز المعقم بتركيز 60% في الماء مع الخلط جيداً. وبعد تجميع الراسب من المعلق، ستكون البيوض عند السطح الفاصل وستظهر بشكل عكر.

انقل كل مجموعة من البيوض إلى طبق NGM Agar قطر 10 centimeter غير مستزرع. يمكن استخدام الماء لشطف X إلى الطبق، ولكن حاول تقليل كمية السوائل المنقولة. حضن الأطباق طوال الليل عند 20 degrees Celsius خلال الساعات القليلة الأولى. قم بتهوية الأطباق بترك الأغطية مفتوحة قليلاً، ولكن تأكد من تغطيتها طوال الليل.

بعد الفقس، انقل يرقات L1 إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مملوء بوسط S basil. قم بترسيب يرقات L1 وإعادة تعليقها في أقل حجم ممكن من وسط S basil. بعد ذلك، قم بتوزيع كل مجموعة من يرقات L1 على طبقين من أغار NGM بقطر 10 سنتيمتر مزروعين ببكتيريا NA 22.

راقب المزارع مرة أو مرتين يومياً. إذا كانت معرضة لخطر النفاد الغذائي، فانقلها إلى أطباق NA 22 جديدة قبل حدوث المجاعة، حيث تشكل خطوط التجميع من النوع N2 وتتحرك معاً كالموجة بعيداً عن المناطق المستنفدة من الغذاء على هذه الأطباق، وسوف ينفد الغذاء تماماً خلال بضع ساعات.

عندما تصل الديدان إلى العمر المطلوب، تصبح جاهزة للتلوين المناعي أو التصوير الحي لتثبيت الديدان. بالنسبة للتصوير البؤري، استخدم وسيط التثبيت Antifa لضبط كثافتها لتصل إلى بضع مئات من الديدان لكل µL.

مع اكتساب الخبرة، يمكن التعرف على هذه الكثافة من خلال عكارة المعلق. ومن الناحية المثالية، يجب أن تكون الديدان متراصة بكثافة على شريحة المجهر، ولكن دون تداخل مفرط. قم بعمل وسادة من 2%aros في ESP basil على الشريحة، محاطة بحلقة رقيقة من الفازلين.

لمنع التبخر أثناء التصوير، يتم وضع الفازلين باستخدام حقنة سعة 3 mL مزودة بإبرة قياس 25 gauge مقطوعة الطرف. الآن، انقل بضع µL من معلق الديدان إلى شريحة غطاء باستخدام رأس ماصة مقطوع الطرف لمنع تمزق الديدان، ثم أنزل وسادة الآغاروز فوق شريحة الغطاء، مع توزيع الديدان بالتساوي فوق الوسادة تحت المجهر. يجب توجيه المشابك العصبية المستهدفة لتكون موجهة مباشرة نحو العدسة أو ضمن زاوية 45 درجة منها فقط.

استغرق بضع ثوانٍ في هذه الخطوة لتجنب بهتان الصور الضوئية. يجب أن توفر المزرعة والظروف ديدانًا كافية لاستيفاء هذا المعيار الصارم الموضح هنا كوضعية مثالية، حيث يكون الحبل البطني موجهًا مباشرة نحو العدسة الشيئية. أما الدودة التالية فسيتم استبعادها لأن الحبل البطني موجه مباشرة بعيدًا عن العدسة الشيئية.

لاحظ كيف أن الحبل الظهري الموجه نحو العدسة في هذه العينة ينتج صورة أكثر وضوحاً. وإليك عينة أخرى سيتم رفضها لأن الحبلين الظهري والبطني موجهان عند حواف الدودة؛ وبذلك، يجب أن يمر ضوء الإثارة والانبعاث عبر المزيد من أنسجة الدودة، مما قد يؤدي إلى تشويه الصورة.

يتمثل التحدي الرئيسي في تقليل التباين داخل مجموعات العلاج؛ لذا فإن تزامن العمر، واختيار الديدان التي يكون فيها التركيب المراد دراسته موجهاً بشكل مباشر نحو العدسة الشيئية، يمكن أن يساعد كثيراً. كما أن البدء بمزارع كبيرة يزيد من خياراتك في اختيار الديدان لتحقيق أقصى قدر من الاتساق. وللحصول على أفضل نتائج التصوير، اختر عينات مسطحة نسبياً بحيث يمكن استيعابها ضمن مجموعة صور (stack) مكونة من 14 صورة أو أقل.

مقاطع بسمك 0.4 micron. تعد الصور عالية السرعة ومنخفضة الدقة كافية لجمع البيانات بدقة وسرعة. تجنب إشباع الكاشف بقوة إشارة مفرطة لأن ذلك سيؤدي إلى تقدير أقل من القيمة الحقيقية لإشارات الفلورة.

يستخدم هذا العرض التوضيحي حزمة برمجيات velocity المتاحة تجاريًا، والتي يجب أن تكون بإصدار 4.0 على الأقل. تفتقر العديد من الخيارات البرمجية البديلة إلى المعلومات ثلاثية الأبعاد. بعد فتح ملفات مخرجات multi tiff الناتجة عن المجهر البؤري (confocal microscope)، اختر image، ثم extended focus، ثم freehand.

قم الآن بقص المناطق من الصورة التي لا تحتوي على البنية محل الاهتمام لتحديد منطقة الاهتمام (ROI). وباستخدام الأداة المفعلة، يوفر التركيز الممتد (extended focus) مسقطاً للمستوى Z لتسهيل عملية اختيار منطقة الاهتمام (ROI). ولا يؤثر هذا الإجراء على البيانات الأساسية.

وبالمثل، فإن تعديلات السطوع والتباين لا تؤثر على البيانات الأساسية. أكمل عملية القص باختيار "actions" ثم "crop to selection". بعد ذلك، قم بقياس طول المنطقة التي تم تحليلها.

باستخدام أداة الخط، سيتم حساب طول الخط وإضافته إلى جدول البيانات. الآن، حدد الكائنات باستخدام مرشح "الكائنات حسب الكثافة" (objects by intensity) في وضع القياسات. قد يساعد إدراج علامة مشبكية مستقلة مُعلمة بلون فريد في تحديد المشابك العصبية بشكل لا لبس فيه؛ حدد عتبة بحيث يتم إبراز التجمعات المشبكية دون إبراز الخلفية غير المشبكية.

قم بإجراء هذه الخطوة مرة واحدة فقط باستخدام عينة ضابطة وطبقها على جميع العينات اللاحقة؛ حيث إن تحديد عتبة كل عينة على حدة أمر غير مقبول لأنه يفتح المجال لـتحيز الباحث. يتم اختيار الكائنات وجدولتها تلقائيًا. وتتراوح المشابك العصبية النموذجية من بضع بكسلات حجمية (voxels) إلى بضع مئات من البكسلات الحجمية. قبل تصدير البيانات، قم بفرز البيانات حسب حجم الكائن.

يسهل هذا الإجراء عملية الإزالة اللاحقة للأجسام التي تتكون من فوكسل واحد أو اثنين، والتي عادة ما تكون مجرد شوائب في الخلفية. الآن، قم بتصدير البيانات بتنسيقات CSV، والتي يمكن فتحها بواسطة أي برنامج جداول بيانات. ينتج عن كل صورة ملف مخرجات واحد لفرز وتصدير الصور المجهرية للحبل العصبي البطني لـ CL gans، حيث تم إنتاج 49 مستقبل GABA باستخدام البروتوكول الموصوف.

بدت جميع الحيوانات متشابهة جداً من حيث الحجم ومرحلة النضج. تم تطبيع قيم الفلورة المشبكية الإجمالية لخمس ديدان، وذلك بناءً على طول الحبل العصبي الذي تم تحليله. وأظهرت هذه البيانات قيم خطأ معياري تبلغ حوالي 10% من المتوسط.

الصورة التي على اليسار هي صورة خام دون تطبيق عتبة (threshold) أو إزالة مواصفات الخلفية. عولجت المشابك العصبية باستخدام mus carmal، وهو ناهض لمستقبلات GABA يتسبب في خفض تنظيم المستقبلات بعد التعرض الطويل. تم قياس الفلورة الكلية ووضعها في سياق معياري بالنسبة للاحتمالية التراكمية لطول الحبل العصبي.

تم حساب المخططات التكرارية لمحتوى الفلورة في المشابك العصبية للأفراد. كما تم حساب الأمر ذاته لحجم المشابك العصبية. وتظهر هذه القياسات أن التعرض للمنبه يقلل بشكل كبير من محتوى وحجم المشابك العصبية.

بشكل عام، يجب أن تعكس النتائج الكمية دائماً ما يمكن تقديره بصرياً. وإذا لم يكن الأمر كذلك، فإن فحص الصور والأجسام التي تم تحديدها بواسطة السرعة من شأنه أن يكشف عن مكان حدوث الخطأ ويقترح إجراءً تصحيحياً مثل تحديد العتبة أو إزالة الشوائب. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من الضروري اختيار الديدان للتصوير بناءً على كيفية توجيهها هندسياً بدلاً من التقييم الذاتي لجودة الصورة، ويوصى بشدة باستخدام التقييم الأعمى قدر الإمكان.