البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج بلورات بروتينية لتجارب حيود الأشعة السينية. يتم استعراض ثلاث تقنيات مختلفة لفحص البلورات، حيث يتم وصف طرق تبلور الانتشار البخاري، بما في ذلك طريقة القطرة المعلقة وطريقة القطرة الجالسة، بالإضافة إلى طرق تبلور الدفعات الدقيقة للتبلور عن طريق الانتشار البخاري. تملأ الآبار بمادة مرسبة.

بعد ذلك، يتم خلط عينة من البروتين المنقى بتركيز عالٍ مع عامل الترسيب. ثم تُختم القطرة المخلوطة في بئر يحتوي على محلول المُرسب. وتبدأ عملية البلورة بالدفعة الصغيرة (Micro batch crystallization) بملء البئر بزيت البارافين.

يتم بعد ذلك تحميل البروتين في الآبار، يليه محلول المرسب. وتتمثل الخطوة النهائية في جميع الطرق في ترك النظام حتى يصل إلى حالة التوازن ومتابعة ظهور البلورات ونموها داخل القطرات. وفي النهاية، يمكن الحصول على بلورات من هذه التقنية وتحديد نمط حيود البروتين باستخدام مصدر للأشعة السينية مع كاشف مناسب.

مرحباً، أنا سال من مختبر البروفيسور يوجا موتيس في قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية والكيمياء الحيوية بجامعة ييل. سنعرض لكم اليوم إجراءً لبلورة بروتين منقى. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الأساس البنيوي للعدوى الفيروسية.

لذا، دعونا نبدأ في تنمية بعض البلورات. ولتحديد طريقة تبلور لجزيء ضخم مختار، يمكن إجراء عمليات فحص أولية باستخدام محاليل تبلور متاحة تجارياً، والتي يتم اختيارها للاستفادة من طريقة المصفوفة المتفرقة ذات العوامل غير المكتملة لظروف التجربة. ويتم اختيار هذه الظروف بناءً على ظروف تبلور معروفة وناجحة عادةً للجزيئات الضخمة.

بمجرد معرفة ظروف البلورة، يمكن إعداد مسح ضيق يتم فيه تغيير تركيز المادة المرسبة في الرقم الهيدروجيني (pH) حول النتيجة الأصلية. عادةً ما تتكون ظروف البلورة المستخدمة في عمليات المسح هذه من مجموعة من المواد المرسبة ومحلول منظم لضبط الـ pH؛ ويجب ترشيح جميع المحاليل المخزنة عبر مرشح 0.22 micron لهذا العرض التوضيحي. تُستخدم ظروف البلورة المحددة مسبقاً لليسوسوم الدجاجي مع كلوريد الصوديوم كمادة مرسبة؛ ابدأ الإجراء بتحضير محاليل بحجم 1 mL من تراكيز مختلفة من كلوريد الصوديوم في أسيتات الصوديوم بتركيز 0.1 molar وبقيم pH مختلفة.

بعد ذلك، يتم إذابة عينة البروتين المخزنة عند -80 °C مع إبقائها على الثلج. تتراوح تركيزات البروتين النموذجية عادةً بين 5 إلى 50 mg/mL، علماً بأن التركيزات الأعلى تعطي عادةً نتائج أفضل. في هذه التجربة، يتم استخدام محلول من ليزوزيم بيض الدجاج بتركيز 50 mg/mL في خلات الصوديوم بتركيز 0.02 M وpH 4.9.

قم بطرد العينة مركزياً لمدة 15 minutes عند 18,000 G ودرجة حرارة 4 °C لإزالة أي بروتينات متجمعة جزئياً أو رواسب ناتجة عن خطوة الإذابة. يمكن لهذه التجمعات أن تعيق نمو البلورات وتحفز المزيد من التجمع. بعد عملية الطرد المركزي.

حدد تركيز البروتين من خلال قياس امتصاصه عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن حساب تركيز البروتين من قراءة الامتصاص ومعامل الانقراض الخاص بالبروتين. بمجرد تجهيز عينة البروتين، املأ صينية بلورة بنظام القطرة المعلقة ذات 24 بئرًا بـ 500 ميكرولتر من محلول المرسب وفقًا لمخطط الصينية.

قم بتكوين حلقة من الشحم السيليكوني حول حافة كل بئر دون إغلاق الحلقة تماماً للسماح للهواء بالهروب من سقف البئر. نظف شريحة الغطاء باستخدام بخاخ الهواء المضغوط أو ممسحة احترافية لتجنب الغبار، مما سيسهل تفسير قطرات البلورة ويقضي على الملوثات. الخطوة التالية هي نقل أحجام متساوية من عينة البروتين ومحلول الخزان باستخدام الماصة إلى شريحة الغطاء.

ومع ذلك، يمكن تجربة أحجام مختلفة من البروتين والمادة المرسبة كجزء من عملية التحسين؛ حيث يؤدي استخدام كمية من البروتين تزيد عن المادة المرسبة إلى تركيز صافٍ للبروتين في القطرة المتوازنة، وهو أمر قد يكون مرغوباً في حالة عينات البروتين المخففة أو لإبطاء عملية تنوي البلورات أو نموها. وفي هذا العرض التوضيحي، يتم وضع 2 µL من الليزوزيم بتركيز 50 mg/mL في 0.02 M خلات الصوديوم عند pH 4 في مركز شريحة التغطية، يليه إضافة 2 µL من محلول البلورة.

عند سحب البروتين ومحلول الخزان بالماصة ووضعهما على الشريحة الغطاء، يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تكون الفقاعات، والتي غالباً ما تحدث عند نفخ الهواء من الماصة. اخلط القطرة برفق للمساعدة في منع ترسيب البروتين المبكر الناتج عن التركيزات العالية للمرسب موضعياً في القطرة؛ ويعد الخلط مهماً بشكل خاص للمرسبات اللزجة مثل polyethylene glycol باستخدام الملقط. اقلب الشريحة الغطاء برفق وضعها فوق حلقة الشحم الموجودة أعلى البئر؛ قم بذلك بطريقة توجيهية بحيث يمكن للهواء الهروب من البئر.

وإلا، فقد يؤدي الهواء إلى رفع شريحة الغطاء، مما يؤدي إلى إضعاف إغلاق البئر. انتقل إلى البئر التالي حتى يتم تجهيز الصينية بالكامل. وبمجرد إعداد الصينية، افحصها بصرياً لإزالة جزيئات الغبار والملوثات الأخرى التي قد تزيد من احتمالية التعرف الخاطئ على بلورات البروتين كإيجابيات كاذبة.

استخدم ورقة تسجيل لتوثيق التجربة. بعد ذلك، ضع الصينية في درجة حرارة الحضانة المطلوبة، والتي تكون عموماً بين 4 °C ودرجة حرارة الغرفة. وتعد درجة حرارة 20 °C هي الأكثر نجاحاً.

احرص على التعامل مع الصينية برفق وتجنب أي اهتزازات أو تغيرات في درجة الحرارة أثناء النقل أو الحضن، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى منع نمو البلورات أو التأثير سلباً على جودتها. افحص الصينية بحثاً عن البلورات في اليوم التالي ثم كل بضعة أيام، مع التعامل دائماً مع الصواني بعناية. قم بتوثيق أي نتائج وأشكال مورفولوجية للقطرات في ورقة تسجيل مخصصة لكل صينية.

تظهر البلورات عادةً خلال يومين إلى خمسة أيام، على الرغم من ظهورها أحياناً بشكل فوري تقريباً أو بعد عدة أشهر. وبمجرد تحديد ظروف التبلور ومعرفة معدل نمو البلورات، يفضل ترك الصواني دون تحريك حتى تظهر البلورات وتنمو إلى نصف حجمها النهائي على الأقل. ومن شأن ترك الصواني دون تحريك أن يقلل من عدد أحداث تنوي البلورات، مما يؤدي إلى تكوين أعداد أقل من البلورات الأكبر حجماً. تتبع طريقة التبلور بالقطرة الساكنة (sitting drop crystallization) نفس إجراءات طريقة القطرة المعلقة (hanging drop)، باستثناء أننا سنستخدم صينية قطرة ساكنة تحتوي على 24 بئراً ولا تتطلب شرائح غطاء.

وبدلاً من ذلك، تحتوي البئر على رف يتم فوقه خلط البروتين والمادة المرسبة؛ وباستخدام الماصة، يتم وضع 2 µL من محلول الليزوزيم بتركيز 50 mg/mL في مركز الرف، مع تجنب تكوين فقاعات هوائية. بعد ذلك، تُضاف 2 µL من محلول المادة المرسبة إلى العينة بعد إعداد الصينية. تُغلق الآبار باستخدام شريط لاصق بصري بطريقة القطرة الجالسة.

لا توجد حاجة لاستخدام شرائح غطاء. استمر في عملية الحضن وتقييم البلورات كما هو موضح في طريقة القطرة المعلقة. لإجراء عملية الدفعة الصغيرة (micro batch).

قم بتحضير محلول البلورة والبروتين كما هو موضح في إجراء القطرة المعلقة. أحضر صينية دفعات صغيرة (micro batch tray) جديدة وقم برشها بالهواء لتجنب وجود الغبار والجزيئات الكبيرة الأخرى في صينية الدفعات الصغيرة. أضف زيت البرافين إلى كل بئر حتى يصل العمق إلى ثلاثة مليمترات.

ثم قم بإزالة الزيت الزائد. بعد ذلك، قم بتحميل 1 µL من محلول البروتين في الفجوة المعبأة مسبقاً، مع التأكد من غوص القطرة إلى قاع الفجوة. ثم قم بتحميل 1 µL من محلول المُرسب في الفجوة.

تأكد من وصول القطرة إلى قاع البئر واندماجها مع قطيرة البروتين. انتقل إلى البئر التالي حتى يكتمل ملء الصينية، ثم تابع عملية الحضن وتحليل البلورات كما هو موضح هنا. النتائج النموذجية لبلورة البروتين.

تظهر التجارب أن الترسيب غير المتبلور يحدث عندما يكون البروتين و/أو العامل المرسّب بتركيز عالٍ. وعلى العكس من ذلك، تظل القطرات غير المشبعة عادةً صافية.

يمكن أن يحدث فصل طوري إذا انفصل البروتين أو المنظف إلى طور مختلف عند خلطه مع مرسبات معينة بتركيز عالٍ. في ظل الظروف المثلى، ينبغي أن تتشكل بلورات بروتين Arabidopsis csn. وتظهر سبع بلورات بروتينية تم الحصول عليها في polyethylene glycol 8,000 وخلات المغنيسيوم على شكل قضبان.

تظهر البلورات الموضحة أيضاً بلورات بروتين الليسوسوم التي تم الحصول عليها في محلول مولاري واحد من كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم عند pH 4.9. يوضح هذا المقطع المرئي بفاصل زمني أن بلورات الليسوسوم تنمو لتصبح مواشور كبيرة خلال بضع ساعات من التحضير عند استخدام طريقة القطرة المعلقة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إعداد تجربة بروتينية عند تنفيذ هذا الإجراء. من المهم العمل في بيئة تخضع لرقابة مستقرة من حيث درجة الحرارة والرطوبة، حيث تساعد الرطوبة العالية على تقليل تبخر القطرة؛ لذا حاول اعتماد تقنية تقلل من تعرض القطرة للهواء الطلق. ولهذا السبب، من الضروري العمل في بيئة عمل منظمة جيداً.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.