النظائر مستقرة من التنميط التمويه الاستقلابية المتوسطة في مرحلة تطوير والكبار انواع معينة ايليجانس

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في المراقبة غير الباضعة للتغيرات الأيضية في الوقت الفعلي على مستوى الحيوان بأكمله ضمن عملية تحلل السكر، وأيض البيروفات، ودورة حمض ثلاثي الكربوكسيل، والتي تنتج عن مسارات أيضية فردية، أو تغيرات جينية، و/أو علاجات دوائية. ويتحقق ذلك عن طريق تغذية الديدان الخيطية الحية بنظائر مستقرة لتوفير إثراء نظائري كافٍ في المزيد من المستقلبات، بما يسمح بتحديد كمية التغيرات الجينية و/أو الدوائية في المسارات الأيضية الوسيطة. وكخطوة ثانية، يتم قياس الدمج النظائري في ثاني أكسيد الكربون الجوي والمذاب بواسطة مطيافية الكتلة لنسب الغازات، مما يوفر تقييماً أكثر مباشرة للتدفق الأيضي الوسيط على فترات زمنية قصيرة.

تتم معالجة العينات التالية لتحليل الأحماض الأمينية الحرة في الديدان الكاملة باستخدام تقنية HPLC، بالإضافة إلى قياس الإثراء النظائري في الأحماض الأمينية والأحماض العضوية بواسطة تقنية GCMS، وذلك لتقدير التغير في التدفق الأيضي في النيماتودا. وبعد التعرض للنظائر المستقرة، تم الحصول على نتائج تظهر تأثيرات مدد التعرض المتفاوتة للنظائر، والتنقية البكتيرية، وطرق تفتيت الديدان البديلة في الديدان من النوع البري (wild type) لاستقصاء الوفرة النظائرية في المستقلبات الوسيطة. ومن شأن هذه الطريقة أن توفر رؤى حول عمليات الأيض الوسيطة.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمتنا، مثل الخطوط الخلوية الثديية والأنسجة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا وجود اختلالات مستمرة في تحليل الأحماض الأمينية الحرة في الديدان باستخدام تقنية HPLC، والتي كانت تشير إلى ضعف في تدفق الاستقلاب الوسيط في وظائف التغيرات التنفسية الأولية. لبدء هذا الإجراء.

تُجمع الديدان التي تعرضت لسلائف أيضية موسومة بنظائر مستقرة، سواء أثناء النمو أو في مرحلة البلوغ، في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 1.5 milliliter. وعادةً ما نقوم بتخفيف الديدان لتصل إلى تركيز 1000 دودة لكل one milliliter. يُضاف حمض per chloric بتركيز 60% يحتوي على epsilon aminocaproic acid كمعيار داخلي إلى الديدان، ليصل التركيز النهائي إلى 4% من حمض per chloric و 20 nanomolar من المعيار الداخلي.

اترك الديدان تترسب بفعل الجاذبية لمدة خمس دقائق، ثم قم بإزالة السائل الطافي وحفظه في أنبوب آخر. تُعد الخطوة التالية أحد أهم الجوانب الحرجة في هذا الإجراء؛ إذ يجب تفتيت الديدان تماماً عن طريق الغربلة قبل تحليل المستقلبات الحرة. باستخدام مجانس بلاستيكي ومثقاب آلي، قم بطحن عينات الديدان لمدة 15 ثانية.

قم بتأكيد تفتت الديدان بصرياً باستخدام المجهر الضوئي، وكرر عملية الطحن إذا لزم الأمر. في هذه الصورة، تُظهر اللوحتان A وB الديدان قبل عملية الطحن. وفي المقابل، تُظهر اللوحتان C وD الديدان بعد عملية الطحن؛ انقل السائل الطافي المحفوظ مسبقاً إلى أنابيب طرد مركزي بلاستيكية سعة 1.5 milliliter مع جهاز الطرد المركزي للمتجانس الدودي.

يتم طرد العينات مركزياً عند 2,250 RPM و 1300 Gs لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، يُنقل السائل الطافي إلى أنبوب زجاجي نظيف سعة سبعة ملليلتر. يتم الاحتفاظ بالراسب لاستخدامه لاحقاً في مقايسة تركيز البروتين.

أضف الآن أربعة من هيدروكسيد البوتاسيوم العادي إلى الـ SUPERNAT حتى يتراوح مدى pH للعينات بين سبعة وثمانية، ثم قم بالطرد المركزي للعينات المتعادلة في أنابيب زجاجية سعة 7 mL بسرعة 2,250 RPM وبقوة 1300 Gs لمدة خمس دقائق. ولإزالة الأملاح، انقل الطافي من كل عينة إلى أنبوب زجاجي جديد سعة 7 mL. يمكن الآن تحضير العينات المتعادلة لتقدير كمية المستقلبات باستخدام تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء أو HPLC، والكروماتوغرافيا الغازية مطياف الكتلة أو GCMS، وبالنسبة لـ HPLC.

افصل 50 µL من كل عينة معادلة للحقن المباشر في جهاز HPLC. يتم تقدير كمية الأحماض الأمينية الحرة باستخدام اشتقاق مسبق بـ al aldehyde والكشف الفلوري. وكما تم وصفه سابقاً، ستخضع العينات المعادلة المتبقية للاستخلاص باستخدام راتنج التبادل الأيوني لـ GCMS لتحديد الإثراء النظيري في الأحماض الأمينية والأحماض العضوية كما هو موضح في القسم التالي.

لتحضير الخرزات، أضف حمض الهيدروكلوريك العادي إلى كل من خرزات G 1 وG 50 بشكل منفصل. في بيكرات سعة لتر واحد، قم بتقليب كل دورق لمدة 30 دقيقة باستخدام محرك مغناطيسي. بعد ذلك، اغسل الخرزات بالماء منزوع الأيونات 10 مرات حتى تصبح قيمة pH لعمليات الغسيل مساوية لقيمة pH الماء.

بعد ذلك، سنعرض طريقتنا لتحضير أعمدة مخصصة منخفضة التكلفة باستخدام ماصات زجاجية. كما تتوفر أعمدة جاهزة تجارياً. لتحضير العمود، استخدم الملقط لإدخال سدادة قطنية فوق أضيق جزء من طرف ماصة باستور مباشرةً، واستخدم حبيبات G 1 لاستخلاص الأحماض العضوية وحبيبات G 50.

لاستخلاص الأحماض الأمينية، املأ كل عمود إلى حوالي ثلث ارتفاع العمود. إذا كانت العينة ذات pH متعادل بالفعل، فلا يتم إضافة أي شيء إلى العينة قبل وضعها في عمود AG one. ولاستخلاص الأحماض العضوية من أجل استخلاص الأحماض الأمينية، أضف 1 mL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.1 normal إلى العينة قبل وضعها في عمود AG 50.

الآن، قم بتطبيق العينات المعاد تعادلها والتي تم تحضيرها مسبقاً على كل عمود. اغسل كل عمود 10 مرات بالماء حتى تصبح غسالات الشطف متعادلة. بعد اكتمال عملية الغسل، قم باستخلاص كل عمود في قوارير عينات زجاجية سعة 4 mL جديدة ومصنفة. لاستخلاص الأحماض العضوية، أضف 3 mL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 3 normal إلى عمود AG 1.

يسمح هذا بتحليل الإثراء النظائري في العدد الإجمالي للكربونات المسمى بين الأنواع الكربونية ثلاثية الكربون، والأنواع الكربونية رباعية الكربون، والأنواع الكربونية خماسية الكربون، والأنواع الكربونية سداسية الكربون. ولاستخلاص الأحماض الأمينية، أضف 3 mL من هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 4 normal إلى عمود G 50. يسمح هذا بتحليل الإثراء النظائري في العدد الإجمالي للكربونات المسمى بين الأنواع الكربونية ثلاثية الكربون والأنواع الكربونية خماسية الكربون.

عند الانتهاء من استخلاص كل من الأحماض العضوية والأحماض الأمينية، ضع قوارير العينات في مبخر reactive app three طوال الليل حتى تجف. بعد ذلك، يتم اشتقاق العينات وتحليلها بواسطة GCMS كما هو مفصل في نص البروتوكول. ابدأ هذا الإجراء بنقل ألف دودة بالغة شابة إلى طبق NGM agri تجريبي بقطر 35 millimeter يحتوي على جلوكوز مُعلم كربونيًا بـ carbon 13 وبكتيريا e coli.

بعد ذلك، ضع طبق NGM التجريبي بدون غطائه في غرفة زجاجية مخصصة مزودة بصمام إيقاف ثلاثي محكم الإغلاق للسماح بأخذ عينات دقيقة من الغلاف الجوي واستبداله. قم بتغطية منطقة الختم حيث يستقر القرص الزجاجي الشفاف بصرياً على الطبق باستخدام شحم تفريغ عالي.

أغلق الغرفة باستخدام القرص الزجاجي، ثم سجل الوقت. بعد مرور 30 دقيقة، والتي تُعتبر نقطة الزمن صفر، استخدم سرنجة سعة 20 milliliter لسحب عينة بحجم 10 milliliters من الغلاف الجوي داخل الغرفة الزجاجية عبر صمام الإيقاف ثلاثي الاتجاهات.

أغلق صنبور التوقف المؤدي إلى الغرفة. بعد أخذ العينة، انقلها إلى أنبوب زجاجي مفرغ من الهواء ذو غطاء أحمر يحتوي على 1 مل من بيكربونات الصوديوم في هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 molar. بعد ذلك، احقن 10 مل من الهواء في الغرفة الزجاجية من خلال صنبور التوقف ثلاثي الاتجاهات. باستخدام سرنجة سعة 20 مل، أغلق صنبور التوقف المؤدي إلى الغرفة. بعد إعادة حقن الغلاف الجوي وقبل استئناف الحضانة، كرر عملية أخذ عينات من الغلاف الجوي من الغرفة الزجاجية عند 60 و90 و120 دقيقة.

قم بتحليل عينات ثاني أكسيد الكربون الجوي هذه للكشف عن إثراء الكربون المسمى باستخدام مطياف كتلة لنسب الغاز كما هو موضح في نص البروتوكول؛ حيث تم دمج النظائر المستقرة بشكل جيد بعد ساعتين في الديدان البالغة الصغيرة، كما يتضح هنا من خلال قياس الكربون المسمى في ثاني أكسيد الكربون الجوي وثاني أكسيد الكربون الذائب في الديدان التي تم تغذيتها إما ببكتيريا OP 50 e coli حية أو مقتولة بالأشعة فوق البنفسجية. كانت نسبة ثاني أكسيد الكربون 13 إلى ثاني أكسيد الكربون 12 أكبر في جزء ثاني أكسيد الكربون الذائب في الديدان مقارنة بثاني أكسيد الكربون الجوي المنطلق. ولوحظ أن التعرض الطويل لنظير مستقر منذ فترة اليرقة، ومن ثم تنقية الديدان على وسط NGM Aate الخالي من البكتيريا، أدى إلى زيادة الإثراء النظيري للجلوتامات الحر في الديدان البالغة الصغيرة.

في هذا الرسم البياني، تمثل L1 الديدان التي غُذِّيت على جلوكوز الكربون 13 المسمى عالمياً وبكتيريا OP 50 من مرحلة اليرقة L1 وصولاً إلى مرحلة البالغ الشاب 959 خلية، بينما تمثل YA الديدان التي غُذِّيت على جلوكوز الكربون 13 وبكتيريا OP 50 لمدة 48 ساعة بدءاً من وصولها إلى اليوم الأول من مرحلة وضع البيض للبالغ الشاب. يشير المحور x إلى العدد الإجمالي لذرات الكربون المسمى في كل نوع من أنواع الجلوتامات، ويشير المحور Y إلى نسبة الإثراء. وقد تم تخليص جميع الحيوانات من الوسم النظائري الزائد قبل تحضير العينات اللاحقة.

بالنسبة لتحليلات GCMS، تشير الأشرطة الخضراء إلى الديدان التي تمت تنقيتها بعد التعرض للنظائر عن طريق التغذية على بكتيريا OP 50 E coli في أطباق NGM لمدة ساعتين قبل استخلاص PCA. وتشير الأشرطة الزرقاء والرمادية إلى الديدان التي تمت تنقيتها بعد التعرض للنظائر في أطباق NGM بدون بكتيريا لمدة ساعتين أو ست ساعات على التوالي قبل استخلاص PCA، بغض النظر عن الجدول الزمني للتعرض للنظائر. لم يلاحظ أي فرق معنوي في الإثراء النظائري في النواتج الأيضية الوسيطة عند تنقية الحيوانات في الأطباق لمدة ساعتين أو ست ساعات.

في كلتا دورتي التعرض للنظائر، لوحظ انخفاض في الإثراء النظيري في المستقلبات الوسيطة عندما تم تطهير الحيوانات عن طريق تغذيتها على بكتيريا غير معلمة لمدة ساعتين. بناءً على ذلك، تم تحديد بروتوكول التطهير الأمثل للديدان التي نمت على أطباق NGM ذات الانتشار البكتيري مع النظير، وهو التطهير لمدة ساعتين على أطباق NGM غير منتشرة لتحسين النسبة المئوية للإثراء في المستقلبات الوسيطة. وذلك بعد المعالجة لمدة 24 ساعة في مزرعة سائلة باستخدام جلوكوز carbon 13 سداسي الكربون بدون بكتيريا.

أُجريت مقارنة بين عينات من الديدان التي تم تكسيرها بواسطة الموجات فوق الصوتية (sonication) وحدها، أو الموجات فوق الصوتية بالإضافة إلى الطحن، كما هو موضح في هذا الشكل. أظهرت الديدان التي كُسرت باستخدام الموجات فوق الصوتية والطحن إثراءً نظائرياً أكبر مقارنة بالعينات التي كُسرت بالموجات فوق الصوتية فقط؛ حيث تم في النهاية تغذية الديدان الحية بسلف نظائري مستقر إما أثناء النمو بدءاً من مرحلة L1 على الأطباق، أو بدءاً من اليوم الأول لوضع البيض كبالغين يافعين لمدة 24 ساعة في مزرعة سائلة. يتيح ذلك إجراء تحليل دقيق للإثراء النظائري بين المستقلبات الدالة على التدفق عبر تحلل السكر (glycolysis)، واستقلاب البيروفات في دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل (tricarboxylic acid Cycle) بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق لأبحاث أمراض الميتوكوندريا لاستكشاف التدفق الأيضي الوسيط في ديدان sea elegance. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التنميط النظائري المستقر للأيض الوسيط والتدفق الأيضي في الديدان الخيطية من نوع The elegance.