الأساسية

في هذا الفيديو، سنعرض لكم كيفية مزامنة ديدان C elegance في مرحلة المستوى الأول. هذه طريقة بسيطة، ولكنها شائعة جداً، لذا ستكون مفيدة للغاية إذا كنت لا تزال في مرحلة المبتدئين.

إذا كنت خبيراً في لغة C، فقد تجد هنا بعض النصائح لتحسين هذا البروتوكول. تعتمد أساساً عملية تزامن الديدان على المقاومة النسبية للأجنة مقارنة بالديدان البالغة لمحلول هيبوكلوريت القلوي. حيث يتم تحضين هذه الديدان البالغة التي تحتوي على العديد من الأجنة بداخلها مع محلول هيبوكلوريت بحيث يتم قتل البالغات وتبقى الأجنة فقط.

يتم تحقيق الجزء الثاني من عملية المزامنة عن طريق حرمان الديدان من الغذاء، بحيث أنه على الرغم من فقس الأجنة في أوقات مختلفة، إلا أنها لا تتطور إلى ما بعد المرحلة L1. تتمثل الخطوة الأولى لبدء بروتوكول التبييض في الحصول على ديدان في مرحلة وضع البيض مع وجود عدة بيضات متناثرة على الطبق. استخدم وسط M9 لاستعادة الديدان البالغة من أجل جمعها.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن كشط الأجنّة الموجودة بالفعل على سطح الطبق باستخدام مادة ناعمة مثل قطعة من فيلم الأشعة السينية، ثم غسل البكتيريا المستخلصة بعدة غسلات بمحلول M9. وعادةً ما تكون غسلتان كافيتين. وبمجرد غسل الديدان، يحين وقت إضافة محلول التبييض المُحضّر حديثاً وفقاً للتفضيلات.

تحكم في وقت الحضن أثناء رج الأنبوب. يمكنك مراقبة تولد البالغين تحت المجهر الستيريو. وبمجرد عدم وجود جثث تقريباً، أوقف التفاعل بإضافة M nine حتى يمتلئ الأنبوب تماماً.

لإتمام البروتوكول، قم بإجراء ثلاث غسلات على الأقل. يتم تحضين البيض في محلول M9 المنظم مع الرج المستمر طوال الليل، مما يسمح بالتفقيس ولكنه يمنع المزيد من تطور الديدان. وعلى الرغم من إمكانية إجراء المزامنة في أي درجة حرارة تتراوح بين 15 و 25 درجة، إلا أنه يوصى بدرجة حرارة 15.

بما أن عملية النمو تكون أبطأ، وكما ذكرنا خلال فترة تطورها، تمر ديدان C. elegans بأربع مراحل يرقانية قبل الوصول إلى مرحلة البلوغ، وتعتمد هذه المدة على درجة الحرارة التي يتم تربيتها فيها. وبينما تتحمل ديدان C. elegans درجات حرارة نمو تتراوح من 15 إلى 25 درجة، إلا أن معدل النمو يكون أعلى عند الدرجات المرتفعة.

عند درجة الحرارة المرتفعة هنا، يمكنك أن ترى كيف تختلف مراحل نمو الديدان بعد مرور 24 ساعة. فبعد 48 ساعة عند درجتي حرارة 15 و25 درجة، نلاحظ بالفعل وجود أجنة عند 25 درجة. ومع ذلك، يجب الانتظار لأكثر من 80 ساعة لرؤية الأجنة على سطح الأطباق.

للحصول على نتائج مثالية عند تربية الديدان في درجة حرارة 15 درجة، يجب مراعاة عدة مسائل عند إجراء تجربة الصعق (blitzing). ومن المهم أيضاً التعرف على الديدان التي وصلت إلى المرحلة المطلوبة لإجراء التجربة. لذا، سنوضح لكم كيفية التمييز بين المراحل إما عن طريق الحجم، أو مجهر تداخل التباين التفاضلي (differential interference contrast microscopy)، أو عن طريق التلوين.

في هذا الرسم البياني، يمكنك ملاحظة معدل نمو ديدان GaN وفقاً لدرجة الحرارة، حيث نجد أنها تنمو بشكل أسرع بكثير عند 25 درجة. وهناك ارتباط بين حجم الحيوان ونموه في العناصر البحرية. وباستخدام البرمجيات المناسبة، يمكن قياس الحيوانات ومن ثم تصنيفها وفقاً للمرحلة النمائية المناسبة.

ومع ذلك، وفقاً لهذا الرسم البياني، يُعد الموقع مؤشراً عاماً لمراحل النمو. ويمكن تحقيق تحديد أدق للمراحل من خلال ملاحظة أجزاء من البحار، وهي تشريحات يمكن استخدامها والتعرف عليها إما عن طريق مجهر التباين بالتداخل التفاضلي أو صبغة DPI. في مختبرنا، استخدمنا هذا البروتوكول لمزامنة الديدان لتجارب مختلفة مثل البيض الدقيق في الصبغ الأحادي، والتصوير الموضعي، وصبغة up is.

علاوة على ذلك، يساعدك هذا البروتوكول أيضاً في التخلص من التلوث. يُستخدم مجهر تباين التداخل التفاضلي أو مجهر نومار لتعزيز التباين. في العينات الشفافة غير المصبوغة، يتم تثبيت الحيوانات حية على قاعدة من Agros بتركيز 2%، حيث يمكن تحضير Agros مسبقاً وتخزينه عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية عند الحاجة.

يمكن صهرة وحفظه عند 65 درجة. وبمجرد صهر الـ agros، ضع بعض الشريط اللاصق على شريحة، ثم ضعها على كلا جانبي شريحة ثالثة. خذ كمية من الـ agros بعناية وضع قطرة منها على الشريحة التي لا تحتوي على شريط لاصق.

قم بتغطية الأغروز بشريحة أخرى توضع بشكل عرضي. وبمجرد أن يتصلب المسار، افصل بين الشريحتين عن طريق سحب إحداهما فوق الأخرى بعناية. ستلتصق الوسادة بإحداهما.

أضف بعضاً من مادة Amazon على الوسادة للحفاظ على تثبيت الديدان. اختر بعض الديدان تحت مجهر التشريح وانقلها إلى قطرة lele، مع تجنب إتلاف المسار.

خذ شريحة غطاء وأضف بعض طلاء الأظافر إلى الحواف. ضع شريحة الغطاء بعناية على هذه الشريحة لمنع تكون فقاعات. يمكن ملاحظة التحضير فوراً تحت المجهر. إحدى أسهل الميزات في تشريح C. elegans هي الحلق.

على سبيل المثال، تتميز المرحلة L4 بوجود aava ذات شكل شجرة عيد الميلاد. يمكن الحصول على معلومات مفصلة حول تشريح c elgan خلال مراحل النمو من www.orla.org. ويُعد تلوين Tapis إجراءً شائعاً لتحديد الخلايا الفردية.

يُعد التثبيت باستخدام النفق طريقة سريعة لتثبيت الديدان. ولصبغ DAPI، أضف أولاً قطرة من منظم M9 إلى سطح شريحة مجهرية. ثم التقط بعض الديدان مباشرة من الطبق وانقلها إلى قطرة M9.

تخلص من الفائض من M nine سواء باستخدام ماصة أو باستخدام منديل ورقي ناعم. أضف نفقاً للديدان. كرر هذه العملية.

بمجرد جفاف القطرة الأولى، أضف بعض وسط التثبيت الذي يحتوي على API وover sleep قبل نقل التحضير إلى المجهر. يمكن ملاحظة تطور الـ go بسهولة في warm stent مع api.