الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

تُستخدم الفيزيولوجيا الكهربائية بشكل شائع لدراسة نشاط القنوات الأيونية ذات البوابات الجهدية المؤتلفة في خلايا كلى جنين الإنسان المستنبتة. يتطلب التسجيل الناجح أن تُعبر الخلايا عن القنوات بمستويات كافية على غشاء الخلية ليتم اكتشافها، وأن تُزرع الخلايا بكثافة خلوية منخفضة بما يكفي لعزل الخلايا الفردية. وغالباً ما تعيق عملية تسجيل الخلايا فترات الحضانة الطويلة عند 28 °C اللازمة لهذا التعبير، حيث يحدث عادةً فقدان في التصاق الخلايا واستقرار الغشاء.

يتم هنا عرض طريقة محسنة لزراعة الخلايا والترنسفكشن (transfection) لتجاوز هذه المشكلات. حيث يتم إجراء الترنسفكشن للخلايا بكفاءة متوسطة، ثم تُحضن عند درجة حرارة 28 °C حتى يتم تحقيق التعبير الكافي للقنوات الأيونية. بعد ذلك، تُنقل الخلايا التي خضعت للترنسفكشن إلى شرائح زجاجية بكثافة منخفضة وتُحضن عند درجة حرارة 37 °C لعدة ساعات للسماح بالتصاق الخلايا واستقرار الغشاء.

بمجرد زراعة الخلايا بشكل مناسب، يتم تحديدها عن طريق التعبير المشترك لـ EGFP وتثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp). يمكن إجراء التسجيل أو يمكن تحضين الخلايا مرة أخرى عند 28 درجة Celsius. ولزيادة التعبير السطحي للقنوات، تشير نتائج تجارب التسجيل على الخلايا التي تم نقل الجينات إليها لقنوات الكالسيوم ذات البوابات الجهدية مثل L CAV one أو L CAV two أو L cav three إلى أن القنوات قد تم نقلها والتعبير عنها بنجاح بواسطة الخلايا.

على الرغم من عرض النتائج التمثيلية لـ L CAV three فقط، فقد طورنا في مختبرنا طريقة لتعزيز تعبير جينات القنوات الأيونية ضعيفة التعبير من أجل تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp) في الخطوط الخلوية البشرية. يتمثل النهج التقليدي حالياً في تقسيم الخلايا أولاً على الشرائح الغطائية ونقل جينات القنوات الأيونية باستخدام cDNA البلازميدية، ثم تحضينها لعدة أيام عند 28 °C من أجل تحقيق تعبير عالي الكفاءة للقنوات الأيونية قبل التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي. أما نهجنا الجديد فيقلل بشكل كبير من وقت التحضين المطلوب عند 28 °C قبل البدء في التسجيل.

الآن، ومن خلال تقليل وقت التحضين عند 28 درجة، نجد أن أغشية الخلايا تصبح أكثر استقراراً وتلتصق الخلايا المنقولة بشكل أكبر بالشرائح الزجاجية. وهذا يزيد من عدد الخلايا القابلة للتسجيل ويجعل التجربة أكثر كفاءة بشكل ملحوظ. قبل عملية النقل، قم بتجزئة دورق ممتلئ تماماً من خلايا HEK 2 9 3 T بنسبة واحد إلى أربعة في دورق جديد بمساحة 25 سنتيمتر مربع، وضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5%carbon dioxide.

اترك الخلايا لتلتصق لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات، وبعد مرور أربع ساعات، افحص الخلايا باستخدام تباين التداخل التفاضلي للتحقق من الالتصاق. لاحظ أن الخلايا لم تعد تبدو مستديرة وبدأت في التسطح، كما تظهر الامتدادات أو الأقدام الكاذبة.

ستبدو الخلايا ذات الالتقاء الأقل متشابهة ولكنها ستكون متباعدة بشكل أكبر. وبمجرد أن تلتصق الخلايا، ادمج الكواشف اللازمة لإجراء عملية ترنسفكشن قياسية بفوسفات الكالسيوم. قم بتحضير إجمالي 12 micrograms من DNA في 600 microliters من محلول الترنسفكشن لكل قارورة.

هنا يتم استنساخ cDNA من قنوات أيونية مختلفة في بلازميد P-I-R-E-S two EGFP. ويؤدي نقل ناقل التعبير هذا إلى خط خلايا ثديية إلى إنتاج البروتين الفلوري الأخضر المعزز من نفس mRNA الخاص بالقطعة المستنسخة، وذلك عبر عملية ترجمة تبدأ عند موقع دخول الريبوسوم الداخلي الموجود مباشرة بعد تسلسل التشفير للقناة الأيونية وقبل تسلسل التشفير لـ EGFP. وهذا يتيح تحديد الخلايا التي تم نقل الجينات إليها بنجاح دون تداخل محتمل في وظيفة البروتين قد ينتج عن دمج بروتين EGFP مباشرة مع البروتين المستهدف.

أضف محلول عفن الخلايا (transfection solution) فوق الخلايا بواسطة الماصة على شكل قطرات، ثم قم بتدوير القارورة بلطف وضعها في الحاضنة عند 37 درجة Celsius طوال الليل حتى اليوم التالي. تحقق من كفاءة عملية عفن الخلايا عن طريق فحص الخلايا تحت مجهر فلوري. يجب أن تظهر الخلايا التي تم نقل الجينات إليها بنجاح باللون الأخضر في جميع أنحاء الخلية.

بمجرد التحقق من عملية ترنسفكشن، قم بسحب أربعة إلى خمسة ملليلترات من الوسط الدافئ بعناية باستخدام الماصة وضعها في القارورة المقلوبة. اغسل الخلايا عن طريق قلب القارورة ببطء بحيث يكون سطح الخلايا لأسفل، ثم هز القارورة بحيث يتحرك محلول الغسيل بلطف فوقها. تخلص من الوسط وكرر عملية الغسيل هذه.

كرر الخطوة مرتين إضافيتين. ثم أضف ستة مللي لتر من الوسط إلى الدورق واحضنها عند 37 °C لمدة ساعتين. يطرح التعبير عن القنوات الأيونية للافقاريات بعض التحديات.

أولاً، غالباً ما تكون هذه الجزيئات كبيرة الحجم، وبالتالي قد تستغرق وقتاً طويلاً في الترجمة عند الشبكة الإندوبلازمية. كما أنها قد لا يتم توجيهها بكفاءة إلى الغشاء الخلوي في سلالة خلايا ثديية. وأخيراً، نظراً لأن الأنواع المختلفة تظهر ترددات متفاوتة في استخدام الكودونات، فقد تحتوي الـ CDNAs غير المتجانسة على ترددات عالية من الكودونات غير الشائعة في الخلايا الثديية مثل HEK 2 9 3 T، وذلك للتغلب على بعض هذه الصعوبات.

بعد تحضين الخلايا لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية عقب غسل عملية عفن الخلايا (transfect)، تُنقل الدوارق إلى حاضنة بدرجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة تتراوح من يومين إلى ستة أيام لتمديد فترة التعبير البروتيني. يجب تحديد مدة التحضين تجريبياً لكل نوع من قنوات الأيونات التي يتم التعبير عنها، حيث إن التحضين عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لفترات زمنية طويلة يؤدي إلى انفصال الخلايا وضعف استقرار الغشاء.

يلزم إجراء المزيد من تحضيرات الخلايا قبل البدء في الدراسات الفيزيولوجية الكهربائية. أولاً، قم بإزالة الوسط من الخلايا المنقولة جينياً باستخدام ماصة شفط، ثم أضف 1 mL من محلول التربسين بدرجة حرارة 37 °C في دورق مقلوب. بعد ذلك، أعد الدورق برفق إلى وضعية السطح الملامح للخلايا للسماح للتربسين بالتدفق بلطف فوق الخلايا.

أعد قلب الدورق وإزالة التربسين. ثم أضف 250 µL من التربسين الدافئ مباشرة فوق الخلايا، واحضنها عند 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق حتى تنفصل الخلايا. وفي هذه الأثناء، ضع من ثلاث إلى ثماني شرائح غطائية مطلية بـ poly L lysine في طبق زراعة قطر 60 mm وأضف 5 mL من وسط زراعي دافئ.

بمجرد انفصال الخلايا، قم بتعليقها في أربعة ملليلترات من الوسط الدافئ عن طريق السحب والطرد بالمصّة نحو ست مرات، بعد ذلك، وباستخدام طرف المصّة الدقيقة، اضغط على شرائح التغطية للتأكد من استقرارها في قاع الطبق. ثم أضف من 250 إلى 500 µL من الخلايا المعاد تعليقها. تُحضن الخلايا عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات للسماح لها بالالتصاق بشرائح التغطية.

إن ترك الخلايا لفترة طويلة جداً عند 37 درجة سيؤدي إلى انقسام الخلايا وتخفيف البلازميدات المنقولة. يجب زراعة الخلايا المنقولة بكثافة منخفضة بما يكفي لتكون معزولة عن بعضها البعض كما هو موضح هنا، مما سيسهل عملية التسجيلات الكهروفسيولوجية.

بالنسبة للخلايا التي تتطلب وحدات فرعية مساعدة، غالباً ما يكون من الضروري نقل الخلايا إلى درجة حرارة 28 درجة مئوية وتحضينها لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أيام إضافية قبل التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي. أما بالنسبة للخلايا التي لا تتطلب وحدات فرعية مساعدة، فيتم إجراء التسجيل مباشرة بعد عملية التحضين هذه.

تتكون منصة الفيزيولوجيا الكهربائية المستخدمة هنا من مضخم، وأجهزة تحكم في الماصات المزدوجة تعمل بمحرك، ومجهر فلوري فوقي، وأنظمة تروية. وقد تم تركيب المعدات على طاولة عازلة للاهتزازات، كما تم الحد من الضوضاء الكهربائية الشاردة باستخدام قفص فاراداي من النوع الثاني بارتفاع 40 بوصة. وتتضمن أنظمة التحكم الإلكترونية جهاز كمبيوتر مجهز بـ digit data 1440، وهي واجهة محول من تماثلي إلى رقمي تعمل بالتزامن مع برنامج P clamp 10.1.

يتم تركيب مضخم شاشة الكمبيوتر، والمناول الآلي، ونظام التحكم في تدفق وصلة الصمام جميعاً خارج قفص فاراداي. وفي رف كهربائي معدني قائم بذاته مقاس 19 بوصة، يتم تأريض جميع المعدات الكهربائية بموزع نحاسي وتوصيلها بمحول عزل طبي، والذي يوفر عزلاً للخط، وتأريضاً ثابتاً، وكبحاً لارتفاع التيار المفاجئ. استعد للتجارب من خلال تركيب الماصات الدقيقة المصقولة بالنار بمقاومة تتراوح من 2 إلى 5 mega ohms على حامل الماصات الدقيقة في مرحلة الرأس.

تُملأ ماصات الرقع (patch pipettes) بالمحلول الداخلي، ثم يتم النقر عليها لإزالة فقاعات الهواء، وأخيراً يتم تركيبها على مرحلة الرأس (head stage). بعد ذلك، باستخدام الملقط، يتم نقل شريحة غطاء واحدة تحتوي على خلايا مستزرعة إلى طبق بيتري بلاستيكي سعة 35 مليمتر يحتوي على 3 مل من محلول التسجيل الخارجي في درجة حرارة الغرفة. يجب قياس حجم محلول التسجيل بدقة عند إجراء تجارب الأدوية التي تضاف خلالها كميات معروفة من الدواء إلى الطبق باستخدام ماصة ميكرونية، ثم يوضع الطبق على منصة المجهر.

بعد ذلك، املأ نصف خلية حامل القطب الكهربائي الدقيق بمحلول كلوريد السيزيوم بتركيز 3 molar. ثم أدخل القطب المرجعي في نصف الخلية وضع القطب الأرضي في الحمام باستخدام الموجه الدقيق (micromanipulator)، وأنزِل ماصة الرقعة (patch pipette) في محلول الحمام. قم بمعاينة الخلايا في وضع الفلورة ومركز خلية خضراء ملتصقة ومنعزلة تم نقل الجينات إليها إيجابيًا في منتصف مجال الرؤية.

أثناء وضع الحمام (bath mode)، قم بتقريب ماصة الرقعة (patch pipette) من الخلية. قم بتصفير تتبع الموجة المربعة الملاحظ على شاشة الكمبيوتر. اضبط موضع ماصة الرقعة بحيث تلامس الخلية تماماً، ويبدأ تتبع التيار المربع على الشاشة في التذبذب.

قم بتطبيق شفط خفيف باستخدام محقنة متصلة حتى يتكون ختم جيجا أوم (giga ohm seal). وبمجرد تحقيق ختم جيجا أوم، قم بتحويل البرنامج إلى وضع الرقعة (patch mode). ثم قم بتطبيق نبضة شفط سريعة باستخدام المحقنة من أجل اختراق غشاء الخلية.

ثم انتقل إلى وضع الخلية واستخدم معاملات الخلية الكاملة على المضخم. ولتعويض العابر السعوي، من الضروري موازنة الرقعة بحيث ينتقل محلول التسجيل داخل الخلايا عن طريق الديلزة إلى الخلية التي تم تطبيق الرقعة عليها. أدخل بروتوكولات تثبيت الجهد المخصصة لهذه التجربة هنا.

قام الباحث بتصميم بروتوكول لقياس التيارات الأيونية عبر القنوات الأيونية ذات البوابة الجهدية التي تنتج عند تعديل الجهد عبر غشاء الخلية. في هذه الحالة، نحن بصدد بروتوكول IV يحدد قيام البرنامج بتثبيت جهد الخلية عند -110 millivolts ثم الانتقال (step) إلى -70 millivolts لمدة 250 milliseconds. بعد ذلك يعود الجهد إلى جهد التثبيت عند -110 millivolts، وفي كل مرة تزداد القفزة بمقدار 10 millivolts، بحيث تكون القفزات إلى -70 millivolts، ثم -60 millivolts، وهكذا، حتى تصل القفزة الأخيرة إلى +20 millivolts.

قم بترشيح التيارات المسجلة عند 10 kilohertz باستخدام مرشح Bessel منخفض التمرير (Lowpass Bessel filter) على المضخم، ثم قم برقمنتها بتردد أخذ عينات يبلغ two kilohertz باستخدام برنامج clamp X 10.1؛ استخدم فقط التسجيلات ذات التسريب الأدنى الذي يقل عن 10%. ولأغراض التحليل، تم استنبات خلايا HEK 2 93 T ونقل L Cav إليها، وهي قنوات الكالسيوم الثلاث الموضحة هنا. وقد تم الاستدلال على نجاح نقل الـ CDNAs الخاصة بالقنوات الأيونية غير المتجانسة من خلال الفلورة الناتجة عن ناقل P-I-R-E-S two eeg FP.

نوضح هنا التعبير الناجح لقناة كالسيوم جهدية من نوع cav3 في اللافقاريات. فعندما لا يتم ترنسفكشن الخلايا، لا يمكن استحثاث تيارات الكالسيوم. بينما تولد الخلايا التي خضعت للترنسفكشن تيارات كبيرة عند تطبيق بروتوكولات تثبيت الجهد للخلية الكاملة على هذه الخلايا.

يمكن للباحثين استخدام ظروف فيزيولوجية كهربائية وأنظمة تحليل بيانات متنوعة اعتماداً على متطلباتهم. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام تقديرك الخاص فيما يتعلق بتوقيت التجارب. وبما أن القنوات المختلفة يتم التعبير عنها بكفاءات متفاوتة عند الغشاء الخلوي، فإن الأمر متروك لك لتحديد الاستراتيجية المثلى لزيادة حيوية الخلايا، فضلاً عن تحقيق أقصى قدر من التعبير السطحي للقنوات التي تهتم بدراستها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، نأمل أن تكون قد اكتسبت فهماً جيداً لكيفية استزراع والحفاظ على خط خلوي بشري، بالإضافة إلى كيفية ترنسفكشن (transfection) لـ CDNAs لقنوات أيونية غير متجانسة و CDNAs للوحدات الفرعية في هذه الخلايا، وذلك من أجل التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي.