ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

الهدف العام من هذا الإجراء هو التعبير عن البروتينات السكرية للثدييات مع الارتباط بالجليكوزيل المناسب للثدييات من خلال استهداف البروتينات المؤتلفة إلى المسار الإفرازي الوسيط ER و GOGI. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم المناعة مثل دور المواصفات والأنماط في البنية وإمكانية التنشيط المناعي للأجسام المضادة وشظايا الأجسام المضادة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم الخلايا البشرية للتعبير عن البروتينات البشرية ، والتي توفر المبشر الخلوي المناسب لطي البروتينات المستهدفة وتعديلها بشكل صحيح.

يجب تشغيل شاكر الحاضنة لإنشاء الخلايا عند 135 دورة في الدقيقة ، 80٪ رطوبة ، 8٪ ثاني أكسيد الكربون ، و 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة على الأقل من تلقيح الاستزراع. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية لخزانة السلامة الحيوية ، وقم بتسخين الزجاجات المتوسطة A والمتوسطة B في حمام مائي 37 درجة مئوية. أطفئ مصابيح الأشعة فوق البنفسجية وقم بتعقيم خزانة السلامة الحيوية بمحلول 70٪ من الإيثانول والماء.

قم بتعقيم قارورة نمو إرلينماير سعة 125 مل باستخدام ماصات ذات غطاء تهوية وماصات وماصات وزجاجات وسائط دافئة مسبقا عن طريق الرش بمحلول 70٪ من الإيثانول في الماء. ضع هذه العناصر في خزانة السلامة الحيوية طوال هذا الإجراء. يجب تعقيم جميع العناصر بهذه الطريقة قبل إدخالها إلى خزانة السلامة البيولوجية.

قم بإعداد وسط استزراع طازج لثقافة 30 مليلتر عن طريق سحب 26 مل من متوسط A وثلاثة ملليلتر من متوسط B ونقله إلى قارورة إرلينماير سعة 125 ملليلترا. امزج عن طريق الرج اللطيف ، الدافئ ، قارورة من خلايا HEK 2 93 F المجمدة مسبقا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لإذابة الخلايا جزئيا. يستغرق هذا حوالي دقيقة واحدة ويجب عدم إذابة الخلايا تماما.

بعد ذلك ، قم بتعقيم الجزء الخارجي من القارورة باستخدام 70٪ من الإيثانول في محلول الماء وانقله إلى خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد ، اسحب معلق الخلية وانقله إلى قارورة إرلينماير سعة 125 مليلتر تحتوي على 29 مل من وسط الاستزراع الطازج. أغلق غطاء قارورة الاستزراع وضع القارورة في شاكر الحاضنة لمدة 24 ساعة.

24 ساعة بعد تلقيح الثقافة. تحقق من كثافة الخلية ، وقم بتعقيم قارورة الاستزراع بمحلول الإيثانول والماء بنسبة 70٪ ونقلها إلى خزانة السلامة الحيوية. باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد وجهاز ماصة ، اسحب ببطء 100 ميكرولتر من المزرعة وانقلها إلى أنبوب معقم سعة 0.5 ملليلتر.

أغلق غطاء قارورة الاستزراع وأعد قارورة الاستزراع إلى شاكر الحاضنة في أسرع وقت ممكن. امزج 7.5 ميكرولتر من محلول أزرق ثلاثي مع 7.5 ميكرولتر من الخلايا. تخلط بقوة ثم تنقل 7.5 ميكرولتر من الخليط إلى شريحة عد.

قم بتشغيل عداد الخلايا الأوتوماتيكي وضع شريحة العد في غرفة التحميل. يتم تنشيط القارئ التلقائي ويتم حساب الخلايا تلقائيا بوحدات عدد الخلايا لكل مليلتر والنسبة المئوية للبقاء. تحديد حجم مزرعة المتبرع المطلوبة للنقل إلى وسط استزراع جديد للحصول على كثافة خلية تبلغ 300,000 خلية حية لكل مليلتر.

قم بإعداد وسط استزراع طازج كما هو موضح سابقا عن طريق نقل 23 مل من متوسط A وثلاثة ملليلتر من متوسط B إلى قارورة ثقافة جديدة سعة 125 مل. بعد ذلك ، قم بإزالة زجاجات المخزون المتوسطة A والمتوسطة B من خزانة السلامة الحيوية لتقليل مخاطر تلوثها. استرجع قارورة ثقافة الخلايا HEK 2 93 F من الحاضنة.

رشها بمحلول الإيثانول والماء بنسبة 70٪ وضعها في خزانة السلامة الحيوية باستخدام ماصة جديدة. اسحب الكمية الصحيحة للخلايا من المزرعة وانقلها إلى القارورة التي تحتوي على مزرعة جديدة. متوسط. انقل كلتا الثقافتين من خزانة السلامة الحيوية إلى شاكر الحاضنة.

قم بتنمية الخلايا إلى كثافة تقريبية من 2 إلى 3 ملايين خلية حية لكل مليلتر قبل التعداد. تحقق من كثافة الخلية كما هو موضح سابقا وحدد كمية الخلايا للتعداد. باستخدام ماصة مصلية معقمة.

انقل الحجم المناسب لتعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 250 ملليلترا. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد التعقيم ، انقل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المحببة إلى خزانة السلامة الحيوية.

استخدم ماصة معقمة لصب المادة الطافية التي تتكون من إنفاقها. يعيد وسط الاستزراع إرسال الخلايا المحببة بقوة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام 10 ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج ، ونقله إلى قارورة معدة تحتوي على ثقافة تعداء جديدة. متوسط. قم بلف الغطاء الموجود على قارورة زراعة الخلايا ذات التهوية واحتضان القارورة في شاكر الحاضنة لمدة 15 دقيقة إلى ساعة واحدة أثناء احتضان الخلايا.

قم بتخفيف مخزون الحمض النووي للبلازما والبولي إيثرامين أو PEI باستخدام وسط الاستزراع الطازج إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر. قم بإزالة قارورة الثقافة مع الخلايا المشتتة من شاكر الحاضنة واصطحبها إلى خزانة السلامة الحيوية باستخدام ماصة دقيقة و 300 ميكرولتر من الحمض النووي للبلازما إلى المزرعة واخلطها عن طريق الرج اليدوي اللطيف عند 900 ميكرولتر من جزيرة الأمير إدوارد في المزرعة واخلطها مرة أخرى. ثم عند 3.8 مل من وسط الثقافة الطازجة.

انقل القارورة إلى شاكر الحاضنة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة من التعداء ، يجب تخفيف ثقافة الخلايا. لتحضير وسط التخفيف أولا، استخدم ماصة مصلية معقمة سعة ملليلتر واحد لسحب مليلتر واحد من حمض الفالبرويك PREWARM 220 ملليمولار أو VPA ونقله إلى أنبوب معقم سعة 50 ملليلترا.

بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية معقمة لإضافة خمسة ملليلتر من وسط التدفئة B و 44 مل من وسط التدفئة A إلى محلول VPA. ينتج عن هذا 50 مل من وسط الاستزراع الطازج بتركيز نهائي يبلغ 4.4 ملليمولار من VPA. استرجع الثقافة المنقولة من الحاضنة.

عقم الجزء الخارجي من القارورة وضع القارورة في خزانة السلامة الحيوية. أضف وسط التخفيف المحضر إلى الثقافة. انقل القارورة مرة أخرى إلى شاكر الحاضنة لمدة أربعة إلى خمسة أيام إضافية بعد التعداد.

راقب صلاحية الخلية يوميا من خلال الإجراء الموضح سابقا. يجب أيضا حفظ الحصص كل يوم لتحليل تعبير البروتين ، بعد خمسة إلى ستة أيام من التعدي أو إذا انخفضت صلاحية الخلية إلى أقل من 50٪ خلايا الحصاد عن طريق الطرد المركزي للخلايا بالإضافة إلى الوسط عند 1000 مرة G لمدة خمس دقائق. جمع المادة الطافية التي ستحتوي على البروتين المفرز في خمسة ملليلتر من محلول التبييض 10٪ إلى بيليه خلية HEK والتخلص منها كخطر بيولوجي.

بعد ذلك ، يتم تنقية البروتين من المادة الطافية التي تم جمعها. ولد نظام التعبير هذا إنتاجية عالية من البروتينات التي تحتوي على الغليكوزيلات كما يتضح من نمط التعبير النموذجي هذا ل IgG one fc بعد التعدي العابر لخلايا HK 2 93 F. أدى تنقية التقارب باستخدام عمود بروتين ل IgG ، أو عمود واحد FC أو النيكل للهيستامين الموسوم ب GFP مع مستقبلات جاما FC ، ثلاثة A ، إلى بروتينات عالية النقاء.

عبر هذا النظام بكفاءة عن IgG المخصب نظائريا في طيف الرنين المغناطيسي النووي ثنائي الأبعاد الذي يربط تردد الرنين لنوى الهيدروجين ونيتروجين الأميد المرتبط مباشرة. شوهدت 15 ذرة إشارات مشتتة جيدا. تم إنتاج أشكال مختلفة من الجليكو مع خلايا HEK 2 93 F و HEK 2 93 s في ظل ظروف زراعة مختلفة كما هو موضح في تحليلات قياس الطيف الكتلي للتأين بالليزر بمساعدة المصفوفة.

IgG واحد FC معبرا عنه من HEK 2 93 s الخلايا ، المأهولة والجليكان التي كانت من شكل خمسة أنوس بالإضافة إلى اثنين من بقايا N acetyl glucosamine التي لا تحتوي على جليكان جلوكوز FU من HEK 2 93 F المواد السريعة كانت أشكال خط سير ثنائية من النوع المعقد مع جلوكوز FU الأساسي ومعظمها تحتوي على N أسيتيل جلوكوزامين طرفي أو نسبة صغيرة من الأشكال الأحادية أو المتوسعة. أظهرت إضافة مثبط للجليكان إلى تعبير تم إجراؤه باستخدام خلايا HEK 2 93 F انخفاضا أكبر بنسبة 90٪ في دمج الفوكو بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال إنشاء التعداء العابر في 1.5 ساعة في اليوم الأول و 15 دقيقة في اليوم الثاني. بعد فترة تعبير من أربعة إلى ستة أيام ، يمكن حصاد المحلول الذي يحتوي على البروتين في 15 دقيقة.

أخيرا ، سيستغرق تنقية البروتين حوالي 1.5 ساعة أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على ثقافة مستقرة قبل تعداء الخلايا التي تنمو بنشاط وإضافة الحمض النووي قبل إضافة PEI. باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التوصيف الوظيفي للبروتين باستخدام مجموعة من التقنيات الفيزيائية الحيوية من أجل استكشاف بنية ووظيفة البروتين السكري المعبر عنه بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف علاقة نشاط الهيكل بين IgG والارتباط بالجليكوزيل في المختبر وفي الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وتنقيته من البروتينات السكرية باستخدام مزيجنا من خلايا K 2 93 F و PZ N اثنان.