الإمكانيات الغشاء ، الردود متشابك ، الدارات العصبية ، تعديل العمليات العصبية والأنسجة العضلية باستخدام جراد البحر : تمارين مختبر طالبة

تتمثل الأهداف العامة للتجارب التالية في فهم خصائص الأغشية القابلة للاستثارة والأساس الأيوني لجهد الغشاء وقت الراحة، وتعلم طرق قياس جهد الغشاء بالإضافة إلى إثبات خصائص النقل المشبكي. وفي جزء من التجربة، سيتم قياس جهد الغشاء وقت الراحة مع تغيير تركيز البوتاسيوم خارج الخلية. وفي جزء آخر من التجربة، سيتم استقصاء آليات التمايز المشبكي عن طريق تسجيل الاستجابات المشبكية المحفزة في وحدات حركية مختلفة.

بعد ذلك، يتم عرض دائرة عصبية يسهل الحفاظ عليها. يمكن استخدام هذا التحضير لأغراض التدريس وكذلك للبحث في جوانب مختلفة من الدائرة التي تمتد من العضو الحسي إلى الجهاز العصبي المركزي وصولاً إلى العصبون الحركي ثم العضلة. وتوضح هذه المجموعة من التجارب سهولة استخدام نموذج جراد البحر لتناول القضايا المتعلقة بجهد الغشاء والتكامل التشابكي والنقل، والاختلافات الهيكلية لأنواع الألياف العضلية.

تتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام تحضيرة جراد البحر في تدريس مفاهيم وتقنيات الفيزيولوجيا الكهربائية في سهولة التشريح، وقدرة التحضيرة على البقاء حية في محلول ملحي أدنى، وسهولة الحصول على الاستجابات المشبكية، وسهولة تمييز الترتيب التشريحي العام للعضلات. كما يمكن تطبيق هذه التقنيات على تحضيرات أخرى، مما سيعزز فهمنا للفيزيولوجيا المشبكية والتعديل، والاختلافات البيوكيميائية والتركيبية في التحضيرة الموضحة. لبدء الجراحة، اختر جراد بحر يتراوح طول جسمه ما بين 6 إلى 10 cm، وضعه في ثلج مجروش لمدة خمس دقائق لتخديره. لقطع رأس جراد البحر، أمسكه من خلف الرأس باستخدام مقص كبير، مع التأكد من إبقاء أصابعك بعيداً عن متناول مخالب وفم جراد البحر.

قم بإزالة الرأس بسرعة عن طريق إجراء قطع نظيف من خلف عيني جراد البحر، ثم أزل أرجل ومخالب جراد البحر لتجنب الإصابة. قم بإزالة المراسيل (styles) في الذكور والأرجل السابحة (swimmerets) في كل من الذكور والإناث. تخلص من الرأس والزوائد.

بعد ذلك، افصل البطن عن الصدر عن طريق إجراء قطع على طول الغشاء المفصلي الذي يربط بين البطن والصدر. احتفظ بجزء البطن من جراد البحر وتخلص من الصدر، ثم وجه المقص قليلاً نحو الجانب البطني، وبزاوية معينة، قم بإجراء قطع في القشرة على طول الحافة الجانبية السفلية لكل جانب من جوانب البطن. احذر من القطع بعمق زائد في جسم جراد البحر.

تتبع نمط خطوط القشرة الطبيعية في جراد البحر والتي تمتد على طول كل قطعة باستخدام الملقط. قم بإزالة الجزء البطني من القشرة عن طريق سحبه للأعلى وللخلف، مع الحرص على عدم إتلاف العضلات البطنية.

قم بإزالة العضلات القابضة. في هذه المرحلة، يمكن رؤية كتلة بيضاء من الأنسجة فوق العضلات القابضة العميقة. قم بإزالة هذه الأنسجة بعناية باستخدام الملقط.

يظهر الآن الجهاز الهضمي كأنبوب صغير يمتد على طول الخط الناصف للعضلات القابضة العميقة. قم بإزالته عن طريق الإمساك به بملقط من الأعلى وسحبه بعيداً عن البطن. ثم اقطع الجزء السفلي من الجهاز الهضمي عند نهاية الذيل.

اشطف عينة التشريح بمحلول ملحي للتأكد من أن الفضلات البرازية لا تتداخل مع التحضير. وباستخدام دبابيس التشريح، ثبت الزوايا العلوية والسفلية للتحضير في طبق بتري مطلي بـ S guard. وبذلك تصبح العضلات الباسطة للبطن مكشوفة الآن.

صُب المحلول الملحي في طبق بتري لتغطية العينة حتى يتم إجراء التسجيلات داخل الخلوية. انقل طبق بتري إلى المجهر واستخدم الشمع أسفل الطبق لمنعه من التحرك. يظهر الجهاز المستخدم للتسجيلات داخل الخلوية في هذا الشكل.

وردت التوصيلات والإعدادات المناسبة في النص المصاحب. قم بضبط برنامج المخطط المختبري وفقاً للإرشструкtions. وكما هو موضح في النص المصاحب، ضع السلك الأرضي في حمام المحلول الملحي.

ضع طرف ماصة زجاجية دقيقة مملوءة بـ potassium chloride بتركيز three molar في حمام المحلول الملحي واختبر مقاومة القطب. يجب أن تتراوح مقاومة القطب بين 20 إلى 60 mega ohms. استخدم مقبض الضبط الخشن في المضخم لتحريك الخط على المخطط المختبري إلى الصفر تحت إضاءة عالية الشدة.

انظر عبر المجهر وحدد عضلات DEM الطولية. استخدم مسبار القطب الكهربائي لإدخال القطب داخل الخلوي في ليف عضلي من عضلة DEM. يجب إدخال القطب الكهربائي بالكاد في الليف العضلي.

توخَّ الحذر لضمان عدم اختراق الخلية بالكامل. قم بقياس سعة جهد الراحة. اسحب مؤشر M إلى المخطط من الموقع الموجود في الزاوية السفلية اليسرى من نافذة الرسم البياني.

ضع العلامة M على خط الأساس وحرك المؤشر إلى أدنى نقطة في الإشارة المسجلة. يظهر الفرق بين العلامة والمؤشر النشط في الجانب العلوي الأيمن من الشاشة. هذه القيمة هي جهد الغشاء الراكن.

اقسم الجهد المسجل على مقدار التكبير، وفي هذه الحالة تم استخدام تكبير بمقدار 10 x. ثم قم بتحويل الجهد من الفولت إلى الميلي فولت. بعد تسجيل جهد الراحة لتلك الليفة العضلية، انظر عبر المجهر وقم بإزالة القطب الكهربائي بعناية من الليفة العضلية.

كرر التسجيل داخل الخلوي على ألياف عضلية أخرى. سيقوم الجزء التالي من هذه التجربة بمراقبة تأثير رفع تركيز البوتاسيوم خارج الخلية على جهد الغشاء أثناء الراحة. ستُستخدم ستة محاليل ملحية لسرطان البحر بتركيزات بوتاسيوم تبلغ 5.4 و20 و40 و60 و80 و100 millimolar.

اختر عضلة لا تعاني من الارتجاف لإجراء التسجيل داخل الخلوي التالي بين عمليات التسجيل. استبدل محلول الحمام بمحلول كلوريد البوتاسيوم ذي التركيز الأعلى التالي، مع التأكد من تغطية التحضير بالكامل في كل مرة.

سجل التغيرات في جهد الغشاء لكل محلول. يظهر تأثير رفع تركيز البوتاسيوم خارج الخلية على جهد الغشاء في لقطة الشاشة هذه؛ قم برسم جهود الغشاء في حالة الراحة لكل تركيز من البوتاسيوم على مخطط شبه لوغاريتمي لتركيز البوتاسيوم خارج الخلية مقابل جهد الغشاء. قم بمحاذاة جهد الراحة عند تركيز 5.4 millimolar من البوتاسيوم خارج الخلية.

بالنسبة للمنحنيات الافتراضية والملاحظة، قارن ميل الخط الملاحظ بميل الخط الافتراضي. بعد الانتهاء من هذه التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية، تتمثل الخطوة التالية في فحص تشريح الألياف العضلية ونمط تعصيبها. انقل العينة إلى طبق التثبيت وأضف صبغة ميثيلين الأزرق.

بعد خمس دقائق، قم بإزالة الميثيلين الأزرق وأضف محلول ملحي طازج لسرطان المياه العذبة. ابحث عن العصب الرئيسي الذي يغذي العضلات داخل القطعة الواحدة. ارسم نمط التعصيب لعضلات S-E-M-D-E-L 2D EL وDEM في القطعة.

بعد ذلك، انقل التحضير إلى أسفل خزانة استرداد الأدخنة. قم بإزالة المحلول الملحي وأضف المثبت. المثبت المستخدم هنا هو محلول poin.

الغرض من خزانة استخلاص الغازات هو تجنب استنشاق أبخرة المثبت. كن حذراً جداً لتجنب ملامسة هذا المحلول لبشرتك أو وصوله إلى عينيك. إذا شعرت بحرقة في عينيك، اغسلهما فوراً في محطة غسل العين.

اترك محلول boin على العينة لمدة 10 دقائق تقريباً، ثم استخدم ماصة لاستبدال المحلول بمحلول ملحي. اقطع جزءاً رقيقاً من عضلة DEL one أو DEL two، وضعه على شريحة زجاجية.

قم بتسمية الشريحة. كرر الإجراء لعضلة SEM. استخدم المجهر المركب لعرض نمط نطاقات الساركومير في كلا تحضيري النسيج.

ستبحث السلسلة التالية من التجارب في كيفية تسجيل الاستجابات المشبكية في عضلات بطن جراد البحر. اختر جراد بحر آخر، وقم بفصله عن الرأس. أزل الصدر والزوائد وكشف عضلات البطن الباسطة كما هو موضح في الجراحة.

في الجزء الأول من هذا الفيديو، استخدم المجهر لتحديد العصب الذي يحمل المحاور الحركية إلى العضلات الباسطة. ابحث عن الجزء الذي يكون فيه العصب أكثر سهولة في الوصول إليه. يظهر العصب باللون الأبيض ويمكن رؤيته باستخدام ماصة لرش المحلول الملحي على العينة أو عن طريق النفخ برفق على العينة.

يؤدي ذلك إلى تحريك العصب وبالتالي تسهيل عملية تحديده. ضع قطب الشفط المثبت بواسطة المجهر manipulator مباشرة فوق العصب. اسحب المحقنة برفق لسحب العصب إلى داخل القطب.

يمكنك رؤية العصب وهو يُسحب إلى القطب الكهربائي عبر المجهر. اضبط الإعدادات في برنامج المخطط المختبري كما هو محدد في المقال المصاحب. املأ قطباً مجهرياً زجاجياً بمحلول كلوريد البوتاسيوم بتركيز 3 molar وقم بتوصيله بمرحلة الرأس وجهاز PowerLab.

استخدم مقبض الضبط الخشن في المضخم لنقل الخط الموجود على المخطط المختبري إلى الصفر. قبل إدخال القطب الكهربائي، يجب تشغيل مقبض التبديل ثم إيقافه عدة مرات. ولاختبار مقاومة القطب الكهربائي، قم بقياس سعة القيم الناتجة.

انظر عبر المجهر واستخدم مسبار القطب الكهربائي لإدخال القطب في إحدى الألياف العضلية الطولية، سواء كانت DEM أو DL one أو DL two. احذر من اختراق الليف العضلي بالكامل. أصبحت العينة الآن جاهزة للتجربة.

يُستخدم قطب الامتصاص لتحفيز الحزمة العصبية القطعية، بينما يُستخدم القطب الزجاجي الدقيق لتسجيل الاستجابة المشبكية من ليفة عضلية، مع تشغيل جهاز التحفيز لتحفيز العصب بتردد 1 hertz للحصول على استجابات طورية. بعد ذلك، ضع القطب الكهربائي في ليفة عضلية من نوع SEL، حيث تُعد SEL عضلة توترية.

قم بتحفيز العصب بدفقات قصيرة من النبضات بتردد 10 hertz للحصول على استجابات توترية. قارن بين الاستجابات المسجلة لعضلات DEL وعضلات SEL. لاحظ أن عضلات DEL الطورية تظهر استجابات مشبكية ذات سعة أكبر من عضلات SEL التوترية.

تركز المجموعة التالية من التجارب على العضلات القابضة لسرطان المياه العذبة بدلاً من العضلات الباسطة. ابدأ باستخدام سرطان مياه عذبة جديد، ثم اعزل البطن كما هو موضح في هذه الجراحة. في القسم الأول من هذا الفيديو، ضع تحضير الذيل المعزول في طبق بتري مملوء بالمحلول الملحي، ثم ثبت الذيل والجزء العلوي من التحضير باستخدام الدبابيس.

لاحظ أنه في تجارب dec Caro على العضلات القابضة التوترية، يجب ترك الحبل العصبي البطني سليماً. استخدم مشرطاً لإجراء قطع طولي عبر الغشاء المفصلي بين ضلعين على الجانب البطني من العينة. كن حذراً جداً لكي لا يكون القطع عميقاً للغاية، حيث إن القطع العميق قد يؤدي إلى بتر جذر العصب الحركي، وذلك لضمان عدم تضرر العضلات السطحية.

قم بتنفيذ الخطوة التالية. أثناء الفحص تحت المجهر، استخدم مقصاً أو مشرطاً لإجراء قطع أفقي بدءاً من القطع الطولي في طبقة الغشاء الرقيقة التي تغطي العضلة. قم بتوسيع القطع لعمل سديلة من الغشاء المفصلي، ثم ارفع السديلة إلى الأعلى.

استخدم مقصاً لقص الشريحة الجلدية للكشف عن العضلات القابضة السطحية من أجل إجراء التسجيل داخل الخلوي من العضلات القابضة السطحية. استخدم نفس الأدوات والإعدادات التي استُخدمت لتسجيل جهد الغشاء الراكن والاستجابات المشبكية من العضلات الباسطة البطنية. وكما سبق، استخدم قطباً كهربائياً داخل خلوياً مملوءاً بمحلول كلوريد البوتاسيوم بتركيز 3 molar.

أدخل القطب الكهربائي في ليفة عضلية من العضلات القابضة السطحية، مع الحرص على عدم اختراق العضلة. سجل النشاط التلقائي للجهود postsynaptic الاستثارية (EPSPs). لاحظ الأحجام المختلفة لـ EPSPs، وتحقق مما إذا كانت هناك أي جهود postsynaptic تثبيطية (IPSPs) موجودة.

استخدم فرشاة رسم صغيرة وقم بمسح حافة الجليدة بعناية داخل نفس القطعة التي تحتوي على قطب التسجيل. لاحظ أي تغير في تردد أو حجم الـ EPSPs نتيجة التحفيز في حال لوحظت استجابة أكبر. قد يشير ذلك إلى استنفار عصبونات حركية إضافية استجابةً للتغير في إطلاق العصب الحسي.

قم باستبدال محلول حمام الملح بعناية بمحلول يحتوي على مُعدِّل عصبي، مثل serotonin بتركيز 1 µM أو محلول ملحي مُشبع بـ carbon dioxide. ثم كرر عملية التحفيز باستخدام فرشاة الرسم. لاحظ تأثير تغيير محلول الحمام على النشاط المسجل.

قم بإعادة محلول الغمر الملحي إلى المحلول الملحي العادي ولاحظ عودة نشاط الليفة العضلية إلى المستوى الأساسي. يوضح هذا الشكل جهود ما بعد التشابك الاستثارة (EPSPs) المسجلة في ليفة عضلية ثانية قابضة سطحية. لاحظ الأحجام المختلفة لجهود EPSPs.

تستخدم المرحلة التالية من هذه التجربة قطباً كهربائياً خارج خلوي لمراقبة جهود الفعل من العصبونات الحركية التي تستجيب للنشاط في الدائرة العصبية الممتدة من العصب الحسي إلى الجهاز العصبي المركزي ثم إلى العصبون الحركي. ابدأ بصنع قطب شفط لتحفيز الأعصاب الحسية. قم بسحب قطعة من الأنابيب البلاستيكية فوق لهب.

الخطوة التالية هي تقليم الأنابيب للوصول إلى الحجم المطلوب. وللقيام بذلك، يجب فحص العصب في العينة لتحديد قطر الفتحة المطلوب لقطب الشفط. وبناءً على حجم جراد البحر، يمكن أن تختلف أحجام الحزم العصبية من حوالي 1 millimeter إلى بضعة millimeters في القطر.

قم بقص الجزء الممتد من الأنبوب لجعل الفتحة الموجودة في الطرف بالحجم الصحيح للإمساك بالعصب. فإذا كانت الفتحة كبيرة جدًا، فقد يسقط العصب منها، أما إذا كانت صغيرة جدًا، فقد يتضرر العصب بسبب ضغط القطب الكهربائي.

ضع الأنبوب البلاستيكي على طرف قطب شفط زجاجي. تختلف إعدادات الفيزيولوجيا الكهربائية والبرمجيات قليلاً عند مراقبة الاستجابات خارج الخلوية مقارنة بإعدادات التسجيلات داخل الخلوية. باستخدام المعدات المحددة في المقال المرفق، قم بشفط المسار الثالث الذي يغذي العضلة الثانية السطحية إلى داخل قطب الشفط.

يمكنك الآن البدء في تسجيل جهود الفعل. يحتوي هذا المسار على خمسة عصبونات حركية محفزة وعصبون حركي واحد مثبط. بعد تسجيل النشاط الأساسي، قم بتحفيز القشيرة باستخدام فرشاة لملاحظة التغير في جهود الفعل المتولدة.

بعد ذلك، استبدل محلول الحمام بمعدلات عصبية مثل serotonin كما في التجربة السابقة، وسجل أي تغيير في الاستجابة. تتوفر تمارين إضافية في النص المصاحب. يوضح هذا التسجيل جهود الفعل المسجلة من المسار الثالث قبل وأثناء تحفيز cuticle باستخدام فرشاة؛ قارن تردد جهود الفعل قبل استخدام الفرشاة بترددها أثناء التحفيز.

يُظهر هذا التسجيل جهود الفعل المسجلة من المسار الثالث في محلول ملحي طبيعي وفي محلول السيروتونين. قارن تردد جهود الفعل في المحلول الملحي الطبيعي بترددها في السيروتونين كما هو موضح للتو. يؤدي التحفيز بالفرشاة إلى زيادة تردد الإطلاق مقارنة بالمستوى الأساسي.

كما أظهر النشاط أن السيروتونين يزيد من تردد الإطلاق مقارنة بالمحلول الملحى العادي. ويوضح هذا الشكل أنه عند الجمع بين التحفيز بالفرشاة والسيروتونين، تحدث زيادة أكبر في تردد الإطلاق. ويشير مقارنة التأثيرات المشتقة خارجيًا ونظريًا لتركيز البوتاسيوم الخارجي على جهد الغشاء الراحة إلى تأثير الأيونات على جهد الغشاء.

لقد أوضحنا لكم أيضاً كيفية تسجيل الاستجابات العصبية في الوصلات العصبية العضلية لكل من العضلات المرحلية والعضلات التوترية. ويمكن استخدام هذه التقنيات في المختبرات البحثية للطلاب لتدريس المفاهيم الأساسية وعلم وظائف الأعضاء. كما يمكن استخدام التقنيات المكتسبة في هذا التمرين المختبري للإجابة على تساؤلات تتعلق بتحضيرات مختبرية أخرى، بالإضافة إلى التطبيقات الفسيولوجية المتعلقة بالطب والصحة.