الفسيولوجية التجريب مع المعى المؤخر جراد البحر : تمرين الطلاب مختبر

الهدف العام من هذا التقرير هو أن يكون أداة تعليمية لطلاب المرحلة الثانوية المتقدمة وطلاب المرحلة الجامعية في دورات علم وظائف الأعضاء الذين يشاركون في التجارب الفسيولوجية. يتعلم الطلاب كيفية كشف وتسجيل انقباضات المعي الخلفي لسرطان المياه العذبة (crayfish). وتتمثل الخطوة التالية في استئصال المعي الخلفي من الحيوان، مما يسمح بالتطبيق المباشر للمركبات.

بعد ذلك، يتمت مراقبة قوة وإيقاع انقباضات العضلات الملساء في المعي الخلفي أثناء تطبيق عوامل صيدلانية متنوعة لفحص الآليات التي تغير قوة الانقباض. ويتم الحصول على نتائج توضح تأثير المعدِّلات على الأعصاب الداخلية أو مباشرة على العضلات بناءً على المقاييس الصيدلانية وتصنيف الأنواع الفرعية للمستقبلات. مرحباً، أنا د. ج. ميرسيه من قسم العلوم البيولوجية في جامعة بروك.

لقد كنت أستخدم المعي الخلفي لسرطان المياه العذبة كتحضير لإجراء أبحاث حول النواقل العصبية التي تتحكم في العضلات الحشوية. كما كنت أستخدم هذا التحضير كأداة تعليمية، وكجزء من تعاون مع مختبر الدكتور Robin Cooper في جامعة Kentucky، فإننا نعمل على تطوير مجموعة من التجارب التي ينفذها الطلاب لأغراض تعليمية. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤية متعمقة حول وظيفة المعي الخلفي لسرطان المياه العذبة.

ويمكن تطبيقه أيضاً في دراسات الأمراض، مثل الأمراض التي تشمل الإيقاعات الدودية. كما يمكن استخدامه لوصف الآليات الكامنة وراء تعديل التعصيب العضلي والعصبي. سيتعلم الطلاب كيفية تفسير البيانات الفسيولوجية والدوائية من خلال استخدام العوامل الدوائية، والنواقل العصبية، والهرمونات العصبية، وسيكتسبون فهماً عاماً لوظيفة المستقبلات.

فيما يتعلق بالمحفزات والمثبطات، سيقوم الطلاب بإنشاء منحنيات الاستجابة للجرعة وعرض البيانات في شكل رسومي للتحليل الإحصائي. ولتخدير الحيوان، يوضع جراد البحر الذي يتراوح طول جسمه بين 6 إلى 10 سنتيمترات على الثلج لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. يُمسك جراد البحر المخدر من خلف المخالب بيد واحدة، ثم يُقطع بسرعة من محجر العين إلى منتصف الرأس على كلا الجانبين، وبعد ذلك يتم فصل رأس جراد البحر.

سيكون الدم الناتج عن التحضير لزجاً عند جفافه، لذا يجب غسل الأدوات عند الانتهاء. بعد ذلك، يتم قطع الأرجل والمخالب. ثم تُقطع الزعانف الذيلية اليمنى واليسرى، مع ترك الزعنفة الذيلية الوسطى، ويُقطع الجانب الظهري من البطن حتى الوصول إلى القطعة الأخيرة.

ثم قم بالقص على طول القطعة الأخيرة وبالاتجاه المعاكس على الجانب الآخر. انزع الصدفة الظهرية. ضع جراد البحر الذي تم تشريحه في طبق بيتري المبطن بالورق الماص.

محلول ملحي رديء لسركان البحر. لتغطية التحضير، استُخدمت دبابيس التشريح لتثبيت العينة في طبق بتري. وعادةً ما يكون المعي الخلفي محاطًا بكتلة من الأوعية الدموية والأنسجة الضامة.

قم بإزالة هذه الأجزاء باستخدام الملاقط، مع الحرص على عدم إتلاف الأمعاء. ستصبح الأمعاء الخلفية الآن مرئية على طول البطن.

اترك تحضير جراد البحر المشرح في المحلول الملحي لمدة 10 دقائق تقريباً حتى يتعافى من صدمة التشريح والتعرض للمحلول الملحي. راقب الانقباضات الدودية البطيئة للأمعاء الخلفية. يمكن الآن البدء في حساب معدل الانقباضات.

قم بعدّ عدد الانقباضات التي تحدث خلال 30 ثانية وسجلها في سجل البيانات. سجل أيضاً نوع الانقباضات التي تحدث وما إذا كانت دودية أو تشنجية. لاحظ اتجاه أي موجات دودية.

قم بحساب معدل الانقباضات بالقرب من الشرج وفي منتصف البطن، وتحقق مما إذا كانت هناك فروق في المعدل بين هاتين المنطقتين. جهز مجموعة متنوعة من محاليل الاختبار بحيث تكون في درجة الحرارة نفسها للمحلول الملحي المستخدم في الحمام. سيكون أول محلول يتم اختباره هنا هو سيروتونين بتركيز 1 µM مُحضّر في محلول ملحي لسرطان البحر.

باستخدام الماصة، قم بإزالة المحلول الملحي من تجويف بطن جراد البحر المكشوف، ثم ضع محلول السيروتونين بتركيز 1 µM مباشرة على المعى الخلفي. فور إضافة المحلول الجديد، انتظر لمدة 30 ثانية ثم قم بعدّ الانقباضات التي تحدث في المنطقة القريبة من الشرج خلال 30 ثانية، ثم عدّ الانقباضات التي تحدث في منتصف منطقة البطن خلال الـ 30 ثانية التالية. سجل هذه الأعداد في جدول، ودون أيضاً نوع الانقباضات التي حدثت. التالي.

قم بسكب المحلول الاختباري من طبق التسجيل واشطف المعي الخلفي عدة مرات بمحلول ملحي طبيعي لسرطان البحر. ثم اشطف التحضير كل 30 ثانية لمدة خمس دقائق. عند هذه النقطة، يمكنك إضافة المحلول الاختباري التالي، وهو في هذا العرض التوضيحي تركيز 1 Micromolar من Topamine.

سجل ملاحظاتك كما فعلت سابقاً وكرر هذه العملية لبقية المركبات المختبرة. عند استخدام تركيزات متعددة من المادة نفسها، تأكد من البدء بأقل تركيز ثم الانتقال إلى التركيزات الأعلى. يتكون نظام قياس قوة انقباضات الجهاز الهضمي (GI) من جهاز كمبيوتر محمول مثبت عليه برنامج lab chart seven، وجهاز bridge pod، وجهاز power lab, 26 T، ومحول قوة (force transducer).

قبل أن تتمكن من قياس قوة انقباضات عضلات الجهاز الهضمي، يجب عليك عزل القناة الهضمية. ولتحقيق ذلك، قم بقص العضلات في الجزء البطني الأخير، وثبّت دبوسين أو أكثر عبر القشيرة البطنية الرخوة على كلا جانبي الشرج، ثم قص بقية البطن، مع ترك المعي الخلفي والشرج متصلين بقطعة صغيرة من القشيرة. يجب قص المعي بالقرب من نقطة التقاء الصدر والبطن.

انقل الآن الجهاز الهضمي إلى طبق ضحل ذي قاع مغطى بطبقة من السرد. يوجد وعاء دموي يمتد على طول الجانب الظهري للجهاز الهضمي؛ قم بسحب هذا الوعاء بعناية بعيداً عن الجهاز الهضمي.

صُب محلول ملحي طازج لسرطان المياه العذبة فوق التحضير. حرّك محول طاقة القوة فوق التحضير. انظر بدقة إلى الدبوس الملحوم بأسفل محول طاقة القوة.

يحتوي الطرف الذي يُثبت في الأمعاء على انحناء صغير. قم بتثبيت الانحناء الصغير للدبوس في الطرف المقطوع من الأمعاء الخلفية. بعد تثبيت الأمعاء الخلفية، حرك الطبق قليلاً حتى تصبح الأمعاء الخلفية مشدودة.

كن حذرًا في هذه الخطوة حيث يجب أن تكون الأمعاء مشدودة، ولكن ليس بقوة مفرطة؛ لأن الشد الزائد قد يؤدي إلى تلف العضلة. عندما يكون الطبق في الوضع الأمثل، استخدم الشمع أو الصلصال لتثبيت الطبق في مكانه.

بعد ذلك، ابدأ بتشغيل البرنامج. لبدء التسجيل، افتح برنامج lab chart. أغلق مركز الترحيب الخاص بـ lab chart.

انتقل إلى الإعدادات (setup) في أعلى اليسار. انقر على إعدادات القنوات (channel settings) في أسفل اليسار. قم بتغيير إعدادات القنوات بحيث تكون هناك قناة واحدة فقط.

انقر على "موافق" في الجانب الأيمن من الشاشة. انتقل إلى القناة الأولى "open bridge pod". اضبط المدى على الإعداد الأكثر حساسية، وهو 200 microvolts في هذه الحالة، في أعلى المخطط في الزاوية اليمنى.

اضبط عدد الدورات في الثانية على 2K. أنت الآن مستعد للتسجيل. انقر فوق "بدء" للتأكد من أن الإعداد يعمل بشكل صحيح.

المس طرف المحول برفق باستخدام ماصة. يجب أن تلاحظ تغيراً في القوة التي يسجلها البرنامج. انقر على "إيقاف" (stop) في البرنامج، ثم انقر على "بدء" (start) واترك البرنامج يعمل.

لمدة 20 ثانية تقريبًا، انقر على إيقاف وأضف تعليقًا بعنوان محلول ملحي. احسب معدل الانقباضات فقط عن طريق قياس الوقت من بداية انحراف واحد إلى بداية الانحراف التالي، أو عن طريق عد إجمالي الانحرافات خلال دقيقة أو دقيقتين. احسب المعدل كعدد الانقباضات في الدقيقة أو عدد الانقباضات في الثانية اعتمادًا على سرعة حدوثها.

لقياس قوة الانقباضات، استخدم مقياساً نسبياً لمقارنة الانقباضات تحت ظروف مختلفة في الملف المحفوظ. حرك المؤشر M إلى خط الأساس، ثم حرك المؤشر إلى ذروة الانحراف وسجل القيمة المدرجة في أعلى يمين الشاشة. هذه قيمة دلتا (delta) التي تمثل الفرق من M إلى الذروة.

لاحظ أنه يجب إبقاء المؤشر ثابتًا عند الذروة لقياس التغيير. بعد ذلك، حرك علامة M والمؤشر إلى شكل الموجة التالي المطلوب واكرر القياس لفحص تأثير المعدِّلات. وفي هذا التحضير، استبدل المحلول الملحي ببطء بمحلول الاختبار.

في هذه الحالة، يُستخدم سيروتونين بتركيز 1 µM، مع الاستمرار في تسجيل معدل وقوة الانقباضات كاختبار أخير. بالنسبة لهذا التحضير، يتم اختبار ما إذا كانت مثبطات الوصلات الفجوية تغير معدل أو قوة الانقباضات، وتشمل مثبطات الوصلات الفجوية 1 HEP أو الإيثانول أو المحلول الملحي الذي تم تمرير ثاني أكسيد الكربون فيه. تُستخدم هذه المركبات في النهاية لأنها قد تسبب تلفاً في الألياف العضلية بعد التعرض لها لفترة طويلة؛ ولمقارنة تأثير المركبات المختلفة، يتم تمثيل البيانات بيانياً على مخطط.

هناك استخدام مثير للاهتمام آخر لهذا التحضير وهو تسجيل القوة التي تولدها العضلات الدائرية. ومع ذلك، إذا كنت قد طبقت مثبطات الوصلات الفجوية على تحضيرك، فقد تكون هذه المثبطات قد ألحقت ضرراً بالعضلات الدائرية، وفي هذه الحالة يجب عليك استخدام تحضير جديد للأمعاء الخلفية لاختبار العضلات الدائرية. ولكشف العضلات الدائرية، قم بشق أنبوب الأمعاء في مستوى طولي باستخدام مقص دقيق.

استخدم دبابيس رفيعة لتثبيت أحد جانبي الشريط بإحكام في الطبق. قم بتوصيل الدبوس المعقوف الموجود على المحول بالجانب الآخر من الشريط. عرّض التحضير لنفس المركبات التي تم اختبارها على العضلات الطولية؛ وتظهر هنا العلاقة بين المركبات المختبرة وعدد ونوع الانقباضات.

يمكنك رسم بياني لعدد الانقباضات مقابل الزمن لمحاليل الملح، والسيروتونين، والغلوتامات. كما يمكنك رسم بياني لعدد الانقباضات مقابل قوة الانقباضات بالملي فولت لمحاليل الملح والسيروتونين والغلوتامات. ويمكن إجراء هذه الرسوم البيانية لكل من العضلات الطولية والدائرية لاختبار ما إذا كانت العضلات الطولية والدائرية في المناطق المختلفة من الأمعاء تظهر استجابات مختلفة تجاه الموديلات (المعدلات) المختلفة.

يمكن تكرار التجارب المذكورة أعلاه في مناطق مختلفة بدءاً من الشرج وصعوداً على طول البطن. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي الحذر لعدم إتلاف الجهاز الهضمي باستخدام الملاقط وعدم السحب بقوة مفرطة باستخدام محول الطاقة. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية للعضلات لمعالجة قضايا أخرى مثل وظائف القنوات الأيونية وتعديلاتها، والتي يمكن أن تعمل كنموذج وأنسجة أخرى في نماذج حيوانية أخرى.