الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح سهولة إجراء تحليل لطخة ويسترن (Western blot) عند استخدام المنتجات المناسبة. فبعد تحضير العينات، يتم فصل البروتينات بناءً على الحجم ثم تُنقل إلى طور صلب. بعد ذلك، يتم فحص البروتينات باستخدام أجسام مضادة وكشفها، حيث يؤدي استخدام البروتوكولات المناسبة والكواشف عالية الجودة وذات التكلفة الفعالة إلى تحسين نتائج تحليل لطخة ويسترن.

أهلاً بكم، أنا جيسي لوهان، باحث في قسم البحث والتطوير في شركة EMD Chemicals في سان دييغو، كاليفورنيا. شركة EMD هي شركة تابعة لشركة Merck, KGAA في دارمشتات بألمانيا. سنعرض لكم اليوم إجراء تحليل اللطخة الغربية (western blotting).

لنبدأ الآن. الخطوة الأولى في عملية اللطخة الغربية (western blotting) هي تحضير العينة. ابدأ تحضير العينة عن طريق تجميع الخلايا في شكل كريسالة باستخدام طرد مركزي منخفض السرعة، مثل خمس دقائق عند 2,500 ×g.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بتصريف الرواسب الخلوية. أعد تعليق الخلايا جيداً في كاشف استخلاص البروتين cyto buster باستخدام 150 µL لكل 10⁶ خلية. احضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، قم بطرد العينة مركزياً لمدة خمس دقائق عند 16,000 ×g في درجة حرارة 4 °C. انقل الـ SNA المصفى إلى أنبوب جديد وابدأ في التحليل. بعد تقييم تركيز البروتين في العينة، قم بتحضير العينة لتحميلها على الهلام بغرض تغيير طبيعة البروتين.

استخدم محلولاً منظماً للعينات يحتوي على منظف مسخ أيوني مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم أو SDS. اغْلِ الخليط عند درجة حرارة 95 إلى 100 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. وباستخدام هلام مسبق الصب متاح تجارياً، يمكن فصل البروتينات بسرعة بناءً على الوزن الجزيئي.

املأ وحدة الفصل الكهربائي بمحلول التشغيل المنظم، والذي يمكن تحضيره من الكواشف المتوفرة ضمن خط المواد الكيميائية Omni PU. قم بتحميل الحارة الأولى من البئر بعلامة بروتينية مرجعية (trail mix protein marker). تحتوي هذه العلامة على ثلاثة نطاقات مرجعية تسمح بالمراقبة أثناء عملية الفصل الكهربائي.

بمجرد صبغ الهلام، تظهر 10 حزم تتراوح أحجامها بين 10 و 225 kilo Daltons. قم بتحميل العينة الممسوخة في الآبار المتبقية. قم بتشغيل الهلام عند 220 فولت لمدة ساعة واحدة.

بمجرد فصل البروتينات، قم بصبغ الهلام بصبغة Coomassie blue للتأكد من أن البروتينات قد هاجرت بشكل متساوٍ ومنتظم باستخدام الصبغ السريع والصبغ فائق الحساسية، وهو جاهز للاستخدام دون الحاجة لـ DS. الصبغ ضروري لأن البروتينات ذات الشحنة الكهربائية يمكن تحفيزها للانتقال عبر الهلام في مجال كهربائي، وبذلك يمكن نقل البروتينات في مجال كهربائي من الهلام إلى غشاء مثل NITROCELLULOSE أو PVDF. عند استخدام أغشية PVDF، اغمر الغشاء في الميثانول لبضع دقائق، يليه موازنة في محلول نقل منظم بارد جداً (في الثلج) لمدة خمس دقائق. قم أيضاً بنقع الهلام لبضع دقائق في محلول نقل منظم بارد جداً؛ حيث تمنع هذه الموازنة انكماش الهلام أثناء عملية النقل.

لإجراء عملية النقل الرطب، قم بتجميع "ساندوتش" يتكون من الهلام والغشاء بين الإسفنج والورق. ثم قم بتثبيت المجموعة معاً بإحكام بعد التأكد من عدم تكون فقاعات هوائية بين الهلام والغشاء. اغمر المجموعة في محلول النقل ثم قم بتطبيق مجال كهربائي.

ستنتقل البروتينات سالبة الشحنة باتجاه القطب الكهربائي الموجب. بعد ذلك، تعمل الغشاء على إيقافها وربطها ومنعها من مواصلة التحرك. وبمجرد اكتمال عملية النقل، يتم تصوير البروتينات للتأكد من حدوث نقل متسق دون وجود فقاعات هوائية.

يمكن القيام بذلك بسهولة باستخدام صبغة red alert لتقنية Western blot. هذه الصبغة جاهزة للاستخدام، ويمكن إزالة الصبغة بسهولة باستخدام الماء. يظهر هنا الجل بعد إزالة الصبغة منه عن طريق الغسل بالماء، وقبل أن يتم تحضين الغشاء بالأجسام المضادة، يتم حجب الغشاء.

لمنع الارتباط غير النوعي، قم بحجب الغشاء باستخدام كواشف حجب عالية الجودة. ولتجنب زيادة الخلفية، قم بتحضين الغشاء في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك الخفيف، ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST أو PBST بعد التحضين. يمكن تحضير هذه المحاليل المنظمة بسهولة ويسر باستخدام أقراص TBS tween وأقراص PBS tween على التوالي.

بمجرد حجب الغشاء وغسله، يمكن تحضينه مع الجسم المضاد الأولي. يتم تطبيق الجسم المضاد الأولي باستخدام المحلول one of signal boost، والذي يسمح بتعزيز الإشارة بشكل ملحوظ. قم بتحضير الجسم المضاد الأولي في المحلول one وحضّن الغشاء لمدة ساعة واحدة.

لا داعي لإضافة المزيد من عوامل الحجب بعد عملية التحضين. اغسل الغشاء بمحلول TBST. بعد ذلك، حضّن الغشاء مع الجسم المضاد الثانوي المخفف في المحلول الثاني من signal boost لمدة ساعة واحدة.

أخيراً، اغسل الغشاء مرة أخرى عدة مرات باستخدام TBST من أجل اقتران HRP. يُستخدم هنا تقليدياً الكشف عن الأجسام المضادة الثانوية عن طريق التلألؤ الكيميائي المعزز أو ECL. يتم استخدام خطوة ECL السريعة لأنها لا تتطلب خلط اللومينول أو المعزز.

ببساطة، قم برش الغشاء بضع مرات، ثم اتركه في الحاضنة لمدة دقيقتين، وقم بتظهيره باستخدام فيلم الأشعة السينية. توفر تقنية Rapid Step حساسية منخفضة بمستوى البيكوجرام، بالإضافة إلى وميض أخف لمدة تصل إلى ساعتين بعد إضافة الركيزة. تتيح واسمات البروتين Trail mix تتبع البروتينات أثناء الرحلان الكهربائي مقارنة ببروتوكولات Western blot القياسية.

يتيح تعزيز الإشارة (Signal Boost) نطاقًا ديناميكيًا وحساسية أعلى. وأخيرًا، يمكن الحصول على حساسية فائقة باستخدام خطوة Rapid بدلاً من كواشف ECL التقليدية. لقد عرضنا لك للتو كيفية إجراء عملية كشف البروتينات بطريقة Western blinding بكفاءة وبتكلفة اقتصادية من خلال مجموعة شاملة من المنتجات.

تذكر أن جودة نتائجك تعتمد على جودة الكواشف المستخدمة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.