تحليل طخة مناعية

يُستخدم التلطيخ المناعي، والذي يُشار إليه غالباً باسم لطخة ويسترن (Western blotting)، لتحديد مستضدات محددة ضمن عينة بروتينية، والتي يتم التعرف عليها بواسطة أجسام مضادة متعددة النسائل أو أحادية النسائل. تلي هذه العملية عادةً الفصل الكهربائي للهلام أحادي أو ثنائي الأبعاد، وتتضمن نقل البروتينات المفصولة إلى أغشية النيتروسليلوز. ثم يتم تحضين هذه الأغشية باستخدام أجسام مضادة أولية وثانوية، تكون مقترنة مباشرة أو غير مباشرة بإنزيمات، ومن ثم يتم تصور المستضدات البروتينية على هذه الأغشية باستخدام تفاعلات الركيزة الملونة أو الفلورية.

في هذا الفيديو، نقدم عرضاً توضيحياً خطوة بخطوة لإجراء عملية اللطخة المناعية. مرحباً، أنا شون غالاغر من UVPI، وأتعاون مع مركز البروتوميات هنا في معهد KE للخريجين. سأقوم اليوم بشرح تحليل اللطخة المناعية.

تتضمن هذه العملية عدة خطوات تشمل فصل البروتينات، ونقل البروتينات إلى الأغشية، والجس المناعي، والتصوير باستخدام ركائز لونية وكيمياء مضيئة. لذا، فلنبدأ الآن. قبل البدء في إجراء البصمة المناعية، يجب أولاً فصل عينات البروتين عن طريق الرحلان الكهربائي باستخدام هلامات أحادية أو ثنائية الأبعاد بأحجام صغيرة أو قياسية.

قم بتحضير العينات المستضدية وتحميلها في مسارات الهلام، مع تضمين بروتين مصبوغ مسبقاً أو بروتين مرتبط بالبيوتين، ومعايير الوزن الجزيئي في مسار واحد أو أكثر من مسارات الهلام. ستنتقل هذه العلامات البروتينية إلى الغشاء، مما يسهل تحديد اتجاه الغشاء وأحجام البروتينات بعد الصبغ المناعي. وبمجرد اكتمال عملية الرحلان الكهربائي، نصبح مستعدين لتجميع لطخة المناعة.

لتجميع لطخة المناعة، ابدأ أولاً بتفكيك شطيرة الهلام وإزالة هلام التجميع، ثم قم بموازنة الهلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل محلول نقل؛ حيث تُعد هذه الموازنة ضرورية لمنع حدوث تغير في حجم الهلام أثناء عملية النقل. وبينما يتم موازنة الهلام، ابدأ في تجميع شطيرة النقل في صينية كبيرة بما يكفي لاستيعاب كاسيت النقل البلاستيكي، مع ملئها بمحلول النقل بحيث يكون الكاسيت مغطى بالكامل. بعد ذلك، ضع وسادة "سكوتش برايت" أو إسفنجة على النصف السفلي من كاسيت النقل البلاستيكي.

بعد ذلك، خذ ورقة ترشيح تم قصها لتكون بنفس حجم الهلام. قم بترطيبها مسبقاً باستخدام محلول النقل المنظم، ثم ضعها فوق وسادة السكوتش برايت. وبمجرد انتهاء فترة موازنة الهلام التي تستغرق 30 دقيقة، ضع الهلام فوق ورقة الترشيح.

قم بإزالة أي فقاعات هوائية بين الهلام وورق الترشيح عن طريق دحرجة أنبوب اختبار أو قضيب زجاجي برفق فوق سطح الهلام. أو يمكنك استخدام أداة الدحرجة من BioRad، والتي تأتي مع مجموعة BioRad. تذكر استخدام القفازات عند التعامل مع أوراق الترشيح والهلامات والأغشية.

سوف تمنع الزيوت الموجودة على يديك عملية النقل. بعد ذلك، قم بتجهيز غشاء النقل. قم بقص الغشاء بحيث يكون بنفس حجم الهلام (gel) مع زيادة واحد إلى اثنين مليمتر على كل حافة.

بعد ذلك، ضع الغشاء في الماء المقطر ببطء بحيث تكون إحدى الحواف بزاوية 45 درجة، وسوف يمتص الغشاء الماء تدريجياً حتى تبتل جميع أسطحه. إذا تم إدخاله في الماء بسرعة كبيرة، فسيتحبس الهواء وتظهر بقع بيضاء في الغشاء، ولن ينتقل البروتين إلى هذه المناطق.

بمجرد أن يصبح الغشاء مبللاً تماماً، يتم توازنه لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة في محلول النقل المنظم (transfer buffer). يعمل إجراء الترطيب هذا مع أغشية النيتروسليلوز والنايلون. أما أغشية PVDF فهي فقط التي تتسم بأنها كارهة للماء، ولن تتبلل بمجرد وضعها في الماء المقطر أو محلول النقل المنظم (transfer buffer).

يجب أولاً غمر أغشية PVDF في ميثانول 100% لمدة ثانية إلى ثانيتين، ثم موازنتها لمدة 10 إلى 15 دقيقة في محلول نقل منظم (transfer buffer). يجب عدم السماح للغشاء بالجفاف في أي وقت.

إذا حدث ذلك، بلل الغشاء مرة أخرى بالميثانول ثم بمحلول النقل. وبمجرد أن يصبح الغشاء جاهزاً، ضعه مباشرة على الجانب العلوي من الهلام. تذكر إزالة جميع فقاعات الهواء الموجودة بين الهلام والغشاء عن طريق تمرير قضيب زجاجي لأنبوب اختبار أو أداة التدحرج من BioRad بلطف فوق سطح الغشاء.

بعد ذلك، قم بترطيب قطعة أخرى من ورق ترشيح واتمان (Watman) بسمك 3 mm. ثم ضعها فوق الغشاء وقم بإزالة جميع الفقاعات الهوائية مرة أخرى. بعد ذلك، ضع وسادة Scotch-Brite أخرى أو إسفنجة فوق ورق الترشيح هذا.

أكمل تجميع شطيرة اللطخة المناعية عن طريق تثبيت النصف العلوي من كاسيت النقل في مكانه. الآن وبعد تجميع شطيرة اللطخة المناعية، أصبحنا مستعدين لنقل البروتينات من الهلام إلى الغشاء. لبدء إجراء النقل، املأ خزان اللطخ الكهربائي بمحلول النقل المنظم، ثم ضع كاسيت النقل الذي يحتوي على الشطيرة داخل جهاز اللطخ الكهربائي.

من المهم ترتيب "الساندويتش" بحيث يواجه الغشاء الأنود أو الجانب الموجب من الخزان. قم بتوصيل أسلاك وحدة امداد الطاقة بجانبي الأنود والكاثود المقابلين في جهاز النقل الكهربائي (electro blotting). يأتي هذا النوع المحدد من أجهزة النقل مزوداً بكتلة تبريد جليدية.

الآن، قم بنقل البروتينات كهربائياً من الهلام إلى الغشاء لمدة تتراوح بين 30 و60 دقيقة بجهد 50 فولت مع التبريد، أو طوال الليل بجهد 14 فولت في غرفة باردة. عند انتهاء عملية النقل، أوقف تشغيل مصدر الطاقة وقم بتفكيك الجهاز. ثم أخرج الغشاء من جهاز النقل (blotting apparatus) وحدد اتجاهه عن طريق قص إحدى الزوايا.

عند هذه النقطة، يمكن تجفيف الأغشية وتخزينها في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الغلق عند درجة حرارة 4 °C لمدة عام واحد. وقبل المتابعة في عمليات المعالجة، يجب وضع أغشية PVDF المجففة في كمية صغيرة من 100% methanol لترطيب الغشاء، ثم في ماء مقطر لإزالة الـ methanol.

بمجرد تحديد الاتجاه، قم بصبغ الهلام للتحقق من كفاءة النقل. ولتصوير البروتينات المنقولة، يمكنك إما صبغ الغشاء بشكل عكسي باستخدام cipro ruby، أو بشكل غير عكسي باستخدام kamasi blue India ink، أو naphthol blue، أو الذهب الغروي. وتعتبر إجراءات الصبغ غير العكسية هذه غير متوافقة مع أغشية النايلون.

بعد نقل البروتينات إلى الغشاء، انتقل إلى عملية السبر المناعي والكشف المرئي عن البروتينات. في هذه الخطوة، يتم سبر البروتينات المثبتة على الغشاء باستخدام أجسام مضادة محددة لتحديد وقياس أي مستضدات موجودة. للبدء، ضع الغشاء في حوض تحضين بلاستيكي يحتوي على 20 milliliters من محلول الحجب.

يستخدم بعض الأشخاص الأكياس، ولكن غالباً ما تُستخدم الصواني بدلاً من ذلك لأنها مفيدة بشكل خاص عند معالجة أعداد كبيرة من الشرائط في محلول أجسام مضادة أولية مختلفة. بعد ذلك، يتم تحضين الغشاء المختوم لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج باستخدام هزاز مداري أو منصة متأرجحة. وأثناء تحضين الغشاء، يتم تخفيف الجسم المضاد الأولي ومحلول حجب الارتباط.

يتم تحديد التخفيف تجريبيًا، ولكنه يتراوح عادةً من 1 إلى 100 إلى 1 إلى 1000. وبالنسبة للأجسام المضادة متعددة النسائل، يكون التخفيف من 1 إلى 10 إلى 1 في 100 لسوائل الطفو من الخلايا الهجينة، وأكثر من 1 إلى 1000 للسوائل الحمضية الفأرية التي تحتوي على أجسام مضادة أحادية النسائل. عند انتهاء الحضن، قم بسكب محلول الحجب.

استبدل المحلول المنظم بالأجسام المضادة الأولية المخففة، ثم حضنها مجدداً لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك المستمر. بعد ذلك، اغسل الغشاء أربع مرات عن طريق التحريك باستخدام 100 milliliters من TTBS للمرشحات المصنوعة من NITROCELLULOSE أو PVDF أو TBS للمرشحات المصنوعة من النايلون.

اغسل لمدة 10 إلى 15 دقيقة في كل مرة أثناء غسل الغشاء، وخفف الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب. تشمل أمثلة الأجسام المضادة الثانوية بيروكسيداز الفجل أو الفوسفاتاز القلوي، أو مترافق anti IG، أو المترافقات الإنزيمية المتاحة تجارياً. وعادةً ما يتم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية بنسبة من 1 إلى 200 إلى 1 إلى 25,000 قبل الاستخدام.

بعد الانتهاء من خطوات الغسل والتخلص من مواد الغسل، أضف بيروكسيداز الفجل (horse radish peroxidase) أو الفوسفاتيز القلوي (alkaline phosphatase) المخفف، والمرافق المضاد للغلوبولين المناعي (anti IG conjugate)، ثم قم بالتحضين لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج المستمر. بعد مرور 30 إلى 60 دقيقة، أخرج الغشاء من الحاوية واغسله أربع مرات، لمدة 10 إلى 15 دقيقة في كل مرة، وذلك باستخدام محلول TTBS كما هو موضح سابقًا.

بمجرد اكتمال عمليات الغسل، نكون مستعدين للمضي قدماً في خطوة التصوير. ولكن أولاً، سنقوم بعرض إجراء بديل لسبر المناعي. يعتمد هذا الإجراء البديل للسبر المناعي على مجموعة Vector Stain ABC من شركة Vector Labs.

يستخدم هذا النظام معقد avidin biotin لربط بيروكسيداز الفجل الحذفي (HRPO) أو الفوسفاتاز القلوي (AAP) بالأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالبيوتين. سنقوم اليوم باستعراض مجموعة HRPO. ويعد TTBS مناسباً جداً كمنظم حجب لأنظمة avidon biotin.

ولكن بالنسبة لمرشحات النايلون، يُنصح باستخدام كواشف ربط البروتين لأن الحليب المجفف خالي الدسم يحتوي على بيوتين متبقٍ، مما سيؤدي إلى التداخل مع المقايسة المناعية. ويجب استخدامه في خطوة الحجب فقط لبدء موازنة الغشاء في محلول الحجب المنظم داخل صينية مفتوحة مع التحريك المستمر باستخدام هزاز مداري أو منصة هزازة. يتم تحضين الغشاء لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء موازنة الغشاء.

قم بتحضير محلول الجسم المضاد الأولي. استخدم TTBS للأغشية المصنوعة من NITROCELLULOSE أو PVDF مع أنظمة Aden. Biotin عالية الحساسية.

تتراوح تخفيفات المصل الذي يحتوي على الجسم المضاد الأولي عادةً من 1 إلى 1000 إلى 1 إلى 100,000. ويتطلب استخدام الكيمياء المضيئة كيميائياً النطاق الأعلى من التخفيفات. وفي حالتنا هذه، نستخدم الطريقة الملونة.

نستخدم تخفيفاً بنسبة 1 إلى 5,000 من الجسم المضاد الأولي. وبمجرد انتهاء عملية الاتزان، قم بإزالة محلول الحجب، ثم أضف كمية كافية من محلول الجسم المضاد الأولي لتغطية الغشاء.

قم بتحضين الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف بعد مرور 30 دقيقة. اغسل الغشاء ثلاث مرات في محلول TTBS المخصص للنيتروسليلوز بفواصل زمنية مدتها خمس دقائق. أثناء خطوة الغسل، قم بتحضير محلول الجسم المضاد الثانوي المبيوتن بتمويع قطرة واحدة من الجسم المضاد المبيوتن في 10 milliliters من TTBS. وبمجرد الانتهاء من خطوات الغسل، أضف محلول الجسم المضاد الثانوي.

قم بتحضين الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج البطيء أثناء تحضين الغشاء مع الجسم المضاد الثانوي. قم بتحضير Avadon biotin HRPO للقيام بذلك. امزج قطرتين من كاشف صبغ vti A وقطرتين من الكاشف B في 10 milliliter.

محلول TTBS لنيتروسليلوز. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة عند اكتمال تحضين الجسم المضاد الثانوي. تُغسل الغشاء ثلاث مرات على مدار 15 دقيقة باستخدام TTBS أو TBS.

بعد ذلك، أضف محلول إنزيم avidan biotin إلى الغشاء واحضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك البطيء. ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات بفواصل زمنية مدتها 10 دقائق باستخدام محلول TTBS. والآن بعد اكتمال إجراء السبر المناعي، تصبح البروتينات المرتبطة بالغشاء جاهزة للتصور باستخدام الركائز المولدة للألوان.

بالنسبة لخطوة التصوير النهائي هذه، تُستخدم الركائز CN dab/ICL 2 وTMB بشكل شائع مع إجراءات الكشف المناعي القائمة على بيروكسيداز الفجل. إذا كانت غسلة الغشاء النهائية أثناء إجراء المسبار المناعي قد أُجريت في TTBS، فقم بغسل الغشاء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وبواسطة 50 milliliters من TBS، ثم ضع الغشاء في محلول التصوير الملون.

يجب أن تظهر حزم البروتين في غضون 10 إلى 30 دقيقة. بعد فترة تحضين مدتها 30 دقيقة، تخلص من خليط تفاعل الركيزة وأوقف التفاعل بإضافة الماء المقطر. يُعد اللطخ المناعي إجراءً متعدد الخطوات تستخدمه آلاف المختبرات للكشف عن وجود بروتينات محددة بعد إجراء الفصل الكهربائي أحادي أو ثنائي الأبعاد.

لقد أوضحت لكم للتو كيفية إجراء تحليل مناعي للدم. هذا كل شيء. بالتوفيق في تجاربكم وشكراً للمشاهدة.