ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تصنيع وتشغيل جهاز للموائع الدقيقة يعيد تهيئة البيئات الدقيقة للأورام مخبرياً، ويمكن استخدامه لاختبار الأدوية الكيميائية. هذا هو جهاز الموائع الدقيقة. يمكن أن يكون هذا الجهاز مفيداً في المجالات التالية، مثل الاختبار السهل للأدوية الكيميائية مخبرياً.

يوفر هذا الجهاز نتائج متسقة ودقيقة لاختبار أنسجة الأورام ثلاثية الأبعاد، كما يقدم تمثيلاً دقيقاً جداً للأورام في الجسم الحي. توجد الأورام في بيئات مجهرية ثلاثية الأبعاد، وتعد القدرة على الاختبار ضمن هذه البيئات أمراً بالغ الأهمية. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في تجميع الجهاز، والتي تتضمن تصنيع شريحة مائعات مجهرية باستخدام الليثوغرافيا الرخوة، وثقب فتحات عند المداخل والمخارج، والربط بشريحة زجاجية، وتوصيل أنابيب لمدخل ومخرج التدفق.

بعد ذلك، يتم إنشاء كرويات ورمية متعددة الخلايا موحدة لاستخدامها في الجهاز باستخدام طريقة القطرة المعلقة. ثم يتم إدخال الكرويات في الجهاز، تليها مواد تحفيز الموت الخلوي المبرمج، وعوامل الكشف، والأدوية الكيميائية. وأخيرًا، يتم إجراء التصوير المجهري بفاصل زمني، يليه تقدير رياضي لمعاملات انتشار الدواء لقياس قدرة العامل الكيميائي على الاختراق.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر نمو الأنسجة في الجهاز، وتكوّن بيئات مجهرية غير متجانسة داخل النسيج، وانتشار الدواء فيه، وذلك باستخدام المجهر الفلوري بنظام التصوير الزمني. ويعد الاختراق المحدود لأدوية السرطان داخل الأورام الصلبة سبباً رئيسياً لفشلها، علماً بأن معظم نماذج اختبار أدوية السرطان الحالية لا تحاكي الطبيعة ثلاثية الأبعاد للأورام الصلبة.

لقد قمنا بتطوير جهاز مائعيات مجهرية يتكون من أنسجة ورمية ثلاثية الأبعاد يتم ترويتها بشكل مستمر. ويمثل هذا النموذج بشكل أكثر دقة عملية إيصال الأدوية إلى الأورام الصلبة وتصفيتها الجهازية. وتُعد الكريات الورمية متعددة الخلايا نموذجاً راسخاً للأنسجة الورمية ثلاثية الأبعاد.

في هذا الإجراء، تُستخدم طريقة القطرة المعلقة لإنشاء أشباه عضويات ستيرويدية لاستخدامها في جهاز الموائع الدقيقة. تسمح هذه الطريقة بتكوين أشباه عضويات متناسقة في فترة زمنية قصيرة. ويمكن أن يساعد اختبار الأدوية الكيميائية العلاجية في المختبر (in vitro) في أنسجة ثلاثية الأبعاد في فحص الأدوية بطريقة أكثر كفاءة مقارنة بطبقات الخلايا الأحادية.

امزج الـ PDMS وعامل المعالجة من المطاط السيليكوني بنسبة وزنية قدرها تسعة إلى واحد. بعد ذلك، صب هذا المزيج فوق القالب الرئيسي لتشكيل طبقة بسمك 4 mm. قم بإزالة الفقاعات الهوائية عن طريق المعالجة عند درجة حرارة 60 °C لمدة خمس ساعات.

قم بنزع مادة PDMS المعالجة من القالب للحصول على ختم بخصائص التدفق على الإلاستومر. بعد ذلك، وباستخدام خرامة خزعات بمقاس 1.5 mm مثبتة على مثقاب، قم بخرق ثقوب للمداخل والمخارج. ثم اسحب أي بقايا ناتجة.

عرض الجانب الذي يحتوي على الميزة من الختم وشريحة زجاجية نظيفة لبلازما الأكسجين لمدة ثماني دقائق. وفي جهاز النقش ببلازما الأكسجين، قم بتلامس الأسطح المعالجة على الفور لتكوين رابطة بينهما. حافظ على المجموعة عند درجة حرارة 60 درجة Celsius على مسخن شرائح لمدة خمس ساعات على الأقل.

لتقوية الرابط، قم بتوصيل أنابيب PTFE بقطر داخلي 0.032 inches بالمداخل والمخارج الخاصة بالجهاز الموائع الدقيقية. وباستخدام واجهة من موصلات Luer lock الذكرية المتصلة بموصلات Luer lock الأنثوية المسننة، تُستخدم هذه الموصلات المحددة للسماح بالمرور من خلالها بسهولة دون تعرضها للكسر. وأخيراً، قم بإعداد مجموعة التدفق باستخدام صمامات غلق وموصل Y، ثم ثبّت الجهاز على المجهر. وبعد تثبيت الجهاز، قم بتوصيل الأنابيب بالمداخل والمخارج المناسبة لإتمام إعداد التدفق.

كما هو موضح في هذا الشكل، يتيح هذا التكوين السهولة والمرونة في تعبئة كروي خلوي (spheroid) داخل الجهاز أو إنشاء تدفق للوسط عبر الجهاز لإتمام عملية التعبئة. افتح صمام مدخل التعبئة VPN وصمام مخرج التعبئة VP out. يمكن بعد ذلك للكروي الورمي أن يمر عبر المدخل ويتدفق إلى غرفة الزرع حيث سيقوم العمود الموجود في هذه الغرفة بتثبيت الورم في مكانه للسماح بتدفق الوسط.

أغلق صمامات التعبئة وافتح صمام مدخل التدفق VF in وصمام مخرج التدفق VF out لبدء تكوين PHE منتظم. باستخدام طريقة القطرة المعلقة، قم بهضم خلايا trypsin تحت غطاء الزراعة. خذ خلايا trypsin الناتجة من جهاز الطرد المركزي.

خفف المحلول المخزون للوصول إلى التركيز المطلوب بالرجوع إلى الجدول رقم 1. بعد ذلك، قم بإزالة غطاء لوحة ذات 48 بئراً وضعها مقلوبة. وفي غطاء تدفق هواء معقم، املأ كل بئر من آبار اللوحة بـ 1 mL من الماء المعقم.

للحفاظ على الرطوبة، ضع قطرة بحجم 20 µL من محلول الخلايا المخفف في كل منطقة دائرية على الغطاء. وباستخدام ماصة دقيقة، اقلب الغطاء بحذر وضعه فوق الطبق، مع التأكد من أن القطرات لا تلامس حواف الآبار. ثم حضّن الطبق عند درجة حرارة 37 °C.

راجع الجدول رقم واحد لمعرفة مدة الحضن بناءً على نوع الخلية المستخدمة، حيث سيتشكل ستيرويد في كل قطرة معلقة. ابدأ بتعقيم الجهاز عن طريق شطفه بـ 70% ethanol من خلال مدخل التدفق. يتبع ذلك الشطف بـ PBS، ثم بوسط زراعة الخلايا المنظم بـ H-E-P-E-S.

اترك سرنجة الوسط، ثم قم بتوصيلها بالأنبوب. بعد ذلك، اسحب من اثنين إلى ثلاثة من الـ Steroids في صنبور السرنجة. لإزالة فقاعات الهواء، قم بتوصيل السرنجة بمدخل التعبئة الخاص بالجهاز.

افتح صمام المدخل VPN وأغلق VFN، ثم افتح صمام المخرج VP out وأغلق VF out. أمسك سرنجة التعبئة بشكل رأسي مع توجيه الإبرة نحو الأسفل. راقب استقرار الستيرويد في قاع السرنجة وصولاً إلى موصل القفل اللولبي (lure lock) الخاص بالإبرة.

اضغط على مكبس محقنة التعبئة وراقب دخول PHE إلى الأنبوب وتدفقه إلى الجهاز لأن صمام مخرج التعبئة فقط هو المفتوح. سيدخل الستيرويد إلى حجرة الجهاز ويتم احتجازه بواسطة القوائم الموجودة في الخلف. وبمجرد دخوله إلى الحجرة، يتكيف S spheroid مع شكل الحجرة ويكتسب هندسة مستطيلة.

أغلق صمام الإدخال VPN وصمام الإخراج VP out، ثم قم بتركيب محقنة التدفق SF على مضخة المحاقن. يتم تشغيل هذه المضخة بواسطة جهاز كمبيوتر باستخدام برنامج syringe pump pro؛ افتح صمام الإدخال VFN وصمام الإخراج VF out. ابدأ تدفق الوسط إلى الجهاز بمعدل 3 µL في الدقيقة.

يتبع تحضين الكريات لمدة 24 ساعة إدخال عوامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج. وقبل إدخال عوامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج أو العوامل العلاجية، اترك الكريات حتى تصل إلى حالة التوازن لمدة تصل إلى 24 ساعة لتكوين تدرجات المغذيات والبيئات الدقيقة. بعد ذلك، أغلق الصمام VFN.

أوقف مضخة المحقنة. قم بإزالة المحقنة من المضخة واستبدالها بالمحقنة التي تحتوي على الوسط المزود بـ 0.25 microliters per mil من كاشف CASP glow red active Caspase three. اغسل الجهاز بالمحلول عن طريق دفع 0.7 milliliters منه يدوياً عبر الجهاز.

ثم قم بتركيب المحقنة على المضخة. أعد تشغيل التدفق وافتح الصمام VFN. وعلى مدى فترة تتراوح من خمس إلى ثماني ساعات، سينتشر cask glove red active cph phase three في النسيج ويُظهر فلورة أكثر سطوعاً في المناطق التي تمر بمرحلة الموت الخلوي المبرمج. يتم الحفاظ على عامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج بهذا التركيز في جميع محاليل التدفق اللاحقة.

يتم إدخال الـ Doxorubicin بعد مرور خمس إلى ثماني ساعات من إدخال عوامل الكشف عن الموت الخلوي المبرمج (apoptosis). يتم التخلص من هذه المعالجة من النظام عن طريق الغسل. لإضافة العوامل الكيميائية العلاجية، اتبع إجراء الكشف عن الموت الخلوي المبرمج لإدخال 10 micromolar من doxorubicin hydrochloride.

بعد ذلك، استبدل سرنجة العلاج بالسرنجة التي تحتوي على 0.7 milliliters من الوسط. استمر في تدفق العامل العلاجي لفترة زمنية محددة. ثم أغلق الصمام VFN وأوقف تشغيل مضخة السرنجة.

قم بإزالة سرنجة المعالجة من مضخة السرنجات واستبدلها بسرنجة تحتوي على 0.7 milliliters من الوسط الغذائي. اترك الوسط الغذائي الجديد يتدفق لمدة تتراوح من 24 إلى 36 ساعة مع المراقبة المستمرة للأنسجة تحت المجهر. تمت أتمتة عملية الحصول على الصور بالكامل للمجهر بنظام التصوير الزمني (time lapse microscopy) باستخدام نص برمجي مخصص في IP lab، حيث تم التقاط صور الضوء النافذ والصور الفلورية لـ PAX Foid بتكبير 10 x كل 30 دقيقة. وللتقدير الرياضي لمعاملات انتشار الدواء، تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء ملفات تعريف متوسط الكثافة الخطية لفلورة الأدوية باستخدام image J. اختر منطقة اهتمام مستطيلة، أو ROI تشمل النسيج الموجود في الغرفة.

استخدم أمر plot profile لإنشاء ملف تعريف لمتوسطات الشدة كدالة في المسافة من قناة التدفق. كرر هذه العملية لما يصل إلى ثلاث نقاط زمنية مختلفة. بعد ذلك، اطرح متوسط شدة الفلورة للخلفية من ملفات تعريف الشدة التي تم الحصول عليها، وقم بتطبيع كل ملف تعريف باستخدام الشدة القصوى المقابلة للحصول على C كدالة في X و T. حيث تمثل C التركيز المطبع لـ doxorubicin، وتتراوح قيمة C بين صفر وواحد.

تتمثل الخطوة التالية في تقييم معامل الانتشار الفعال لـ docs داخل أنسجة الورم docs. يمكن تمثيل الانتشار من خلال المعادلة التالية حيث يمثل ERFC دالة الخطأ المتممة. X هي المسافة داخل النسيج من القناة، و T هو الوقت المنقضي بعد إدخال doxorubicin.

استخدم المخطط التكراري التالي عند كل نقطة زمنية مدروسة. قم بتخمين قيمة لـ D. احسب الطرف الأيمن من المعادلة عند كل موقع X. احسب مجموع مربعات الخطأ بين الطرفين، ثم عدل D لتقليل متوسط المتبقي إلى أدنى حد.

تُمثّل قيم D المثلى التي تم الحصول عليها عند كل نقطة زمنية لتقدير متوسط معامل الانتشار الفعال للدكسوروبيسين في النسيج. وفرت الأجهزة الموائع دقيقة غرف زراعة يمكن الوصول إليها بصرياً بأبعاد 1 ملم × 0.3 ملم × 0.15 ملم لنمو نسيج ورمي ثلاثي الأبعاد. سمحت طريقة القطرة المعلقة بالتكوين السريع لـ PHE ورمي بحجم وشكل متسقين من عدة خطوط خلوية.

تمت زراعة الخلايا الظهارية الرئوية (PHE) بنجاح على الجهاز لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. وارتبط النمو في الغرف بتعديل قابل للتكرار للبيئات الدقيقة. وبداخل PHE، حدث الموت الخلوي المبرمج (apoptosis) بنسبة أقل في الخلايا القريبة من قناة التدفق، وبنسبة أعلى وأعمق داخل النسيج.

استُخدم الجهاز لتقدير معامل انتشار الدوكسوروبيسين وأنسجة الورم. وقد تطابقت القيمة التي تم الحصول عليها تجريبياً مع القيمة التي تم الإبلاغ عنها سابقاً في سرطان الثدي البشري. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توخي الحذر الشديد للحفاظ على التعقيم عند تدفق PHE في الجهاز لأنه يجب أن يتم خارج مزرعة الخلايا.

قم برش المحاقن ونهايات الأنابيب داخل خزانة التدفق الصفحي بكمية وافرة من الإيثانول لضمان التعقيم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم لدور النفاذ المحدود للأدوية إلى الأورام. لقد استعرضنا تقنية لمحاكاة توصيل الأدوية وتصفيتها الجهازية في أنسجة أورام ثلاثية الأبعاد وقياس مدى نفاذها.

إن استبعاد الأدوية ذات النفاذية الضعيفة سيؤدي إلى تسهيل عملية تطوير أدوية السرطان بشكل كبير.