بعد المشبكي التسجيلات في وارد الاتصال الانشعابيات القوقعة خلايا الشعر الداخلية : رصد النسخة عديد الحويصلات في الشريط المشبك

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل النشاط ما بعد المشبكي عند المشابك الواردة للخلايا الشعرية الداخلية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعريض الظهارة الحسية للقوقعة التي أُزيلت مؤخراً من جرذ مقطوع الرأس. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في وضع القمة المستأصلة على شريحة غطاء معدلة، ثم نقلها إلى غرفة التسجيل.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحديد موقع الوصول إلى ليف صاعد باستخدام قطب تسجيل. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تشكيل ختم محكم على غشاء الليف الصاعد ثم تمزيقه، وذلك لإنشاء تكوين الخلية الكاملة (whole cell configuration) لتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp technique). وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر الحدوث أو الجهود ما بعد التشابكية من مشبك شريطي واحد من خلال الفيزيولوجيا الكهربائية بتثبيت الرقعة للخلية الكاملة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم تشريح وتحضير أنسجة القوقعة، وصعوبة التعرف على الألياف الواردة الصغيرة والوصول إليها. قبل البدء في عملية التشريح، قم بتجهيز شريحة غطاء معدلة ستعمل على تثبيت التحضير في مكانه أثناء التسجيلات. باستخدام شريحة غطاء زجاجية دائرية يتراوح قطرها من 8 إلى 12 مليمتر، ضع قطرة من مادة syl guard نصف معالجة باتجاه حافة شريحة الغطاء.

ضع الطرف السميك لدبوس حشرات دقيق على غطاء الشريحة. ثبت دبوس الحشرات بإحكام مقابل الزجاج. وباستخدام الملقط، قم بتسخين واقي العتبة مقابل ملف ساخن لضبطه.

قم بتجهيز من 10 إلى 20 قطبًا كهربائيًا دقيقًا (micro electrodes) كما هو موضح في النص المرفق. بعد الصقل باللهب باستخدام فرن دقيق (micro forge)، يجب أن يكون القطر الخارجي لطرف القطب الكهربائي الدقيق حوالي 1 micron تقريبًا. يبلغ السمك النهائي لجدار الماصة حوالي 1/3 micrometer، وذلك بعد تخدير وفصل رأس جرذ يبلغ من العمر ثلاثة أسابيع.

ابدأ عملية التشريح بإزالة الجلد، ثم قم بتشريح الرأس وإزالة الدماغ. ولإظهار العظم الصدغي، قم بإزالة العظمين الصدغيين. ضع كل عظم صدغي في طبق تشريح نظيف يحتوي على محلول خارج خلوي قياسي. الخطوة التالية هي إزالة العظم الذي يغلف العظم الصدغي للكشف عن القوقعة.

ثبّت العظم الصدغي بإحكام من القاعدة باستخدام ملقط. حدد موقع النافذة المستديرة والنافذة البيضاوية والقوقعة. وجّه القوقعة بحيث تكون النافذة البيضاوية والجانب الحلزوني من القوقعة متجهين للأعلى.

قم بإزالة العظم الزائد حول القوقعة. استخدم زوجاً ثانياً من الملاقط الدقيقة لنحت العظم مباشرة من القوقعة، بدءاً من المنطقة الأكثر شفافية من بقية العظام؛ حيث يكون العظم هنا أرق وأسهل في الإزالة.

استمر في إزالة العظم من حول اللفة القمية. استخدم مقص تشريح دقيق للقص عبر الموديلوس الموجود أسفل اللفة القمية. ثم افصل اللفة القمية عن اللفات السفلية للقوقعة.

احرص على حماية اللفة القمية، إذ يجب عدم سحبها أو شدها. وأخيراً، قم بإزالة اللفة القمية من القوقعة دون تمزيق الأنسجة بشكل مفرط.

استخدم ملقطًا دقيقًا لإزالة بقية العظم. الخطوة التالية هي إزالة STR of oculis والغشاء التالي. قم بإزالة STR of oculis بعناية، وهي شريط نسيجي لامع يقع خارج منطقة الخلايا الشعرية.

تأكد من تجنب إزالة الخلايا الشعرية الحسية، والتي يمكن أن تنفصل بسهولة مع STR الخاص بـ oculis. بعد ذلك، استخدم ملقطاً دقيقاً لفصل الغشاء التالِي (tial membrane)؛ وهو الغشاء اللامع شبه الشفاف الذي يقع فوق الخلايا الشعرية الحسية، ثم قم بتشذيب الأنسجة والعظام الزائدة وتسطيح العينة باستخدام الملقط.

هذا الأمر ضروري لضمان وضع النسيج بشكل متساوٍ تحت الدبوس. وبذلك تكتمل عملية التشريح. ضع العينة تحت الدبوس على شريحة التغطية المُجهزة، مع الحرص على وضع الدبوس بعيداً عن الخلايا الشعرية بمجرد الانتهاء من التشريح.

استخدم الملاقط لنقل التحضير إلى غرفة التسجيل مع الحفاظ على قطرة من السائل خارج الخلوي على غطاء الشريحة الذي يحمل نسيج القوقعة، ثم ابدأ فوراً بعملية الإرواء بالمحلول خارج الخلوي. ولضمان بقاء التحضير على قيد الحياة بشكل أفضل، استخدم العدسة الشيئية 10 x للمجهر أو عدسة DIC الغاطسة في الماء 40 x. ولتحديد موقع التحضير، قم بتوجيهه بحيث يمكن لأقطاب التسجيل الاقتراب من الخلايا الشعرية الداخلية بزاوية قائمة مع جدرانها الجانبية.

إذا كانت رؤية المنطقة القاعدية للخلايا الشعرية الداخلية محدودة بسبب التواء العينة، فاستخدم قطب تسجيل لدفع الحافة الخارجية للعينة للأسفل باتجاه الشريحة الزجاجية الغطائية، مع الحرص على تجنب الضغط على الخلايا الشعرية الداخلية نفسها. في هذا التحضير، يقوم القطب العلوي بتثبيت الحافة الخارجية للعينة للأسفل، بينما يحدد القطب السفلي موقع العصيات الواردة.

للمرجعية، تعرض كاميرا NC 70 Nuv Con صورة Forex المكبرة على الشاشة لتقييم ما إذا كانت الأنسجة في منطقة الخلايا الشعرية الداخلية سليمة. حدد الحزم الشعرية كنقطة مرجعية ثم قم بالتركيز لأسفل للعثور على النوى. استمر في التركيز لأسفل باتجاه قاعدة الخلايا الشعرية الداخلية مع نهاياتها الواردة، ثم عد للأعلى حتى تصل إلى مستوى النوى على الشاشة.

حدد الآن موقع العصي الواردة حول قاعدة الخلايا الشعرية الداخلية. تكون العصي كروية أو بيضاوية الشكل، ويبلغ قطرها حوالي 1 ميكرون، وتتميز بلون فاتح ومظهر لامع. يمكنك العثور عليها من خلال ضبط التركيز للأعلى وللأسفل.

تتمثل الخطوة التالية في تمهيد مسار إلى الألياف الواردة باستخدام قطب تسجيل ذي طرف يبلغ حجمه 1 micron مملوء بمحلول داخل خلوي. يتم تطبيق ضغط إيجابي واستخدام الميكرو-مانيبيوليتور (micro manipulator) لتوجيه القطب نحو العينة. استخدم هذا القطب لإجراء شق في العينة عند مستوى قاعدة الخلية الشعرية الداخلية.

ادفع القطب الكهربائي بين الطبقة الرقيقة من الخلايا الداعمة وخلايا الشعر الداخلية باستخدام الضغط الإيجابي لفتح مسار وصول إلى المنطقة الموجودة عند قاعدة خلايا الشعر الداخلية. قم بإزالة القطب الكهربائي بعناية واستبدله بقطب كهربائي جديد ذو طرف بقطر 1 micron مملوء بالمحلول داخل الخلوي. وباستخدام الضغط الإيجابي للحفاظ على نظافة طرف القطب، حرك قطب التسجيل عبر فتحة الوصول حول الخلايا الداعمة المجاورة باتجاه العصا الواردة (afferent baton).

تأكد من أن طرف القطب الكهربائي يقع مباشرة أمام الزر الوارد؛ حيث توفر الأزرار مقاومة أكبر لحركة الماصة مقارنة بالخلايا الداعمة وغشاء الخلايا الشعرية الداخلية. يمكن الشعور بهذا الفرق أثناء تحريك الماصة، لذا قم بتحريك الماصة للأعلى والأسفل وادفعها للتأكد من تحرك الزر. يشير ذلك إلى أن طرف الماصة والزر يقعان في نفس المستوى البؤري مع ضغط القطب مقابل الزر الوارد. في الوقت ذاته، قم بتحرير الضغط الإيجابي وتطبيق عملية الشفط لتكوين سدادة جيجا أوم (giga ohm seal).

قم بتطبيق نبضات شفط خفيفة لتمزيق الغشاء داخل القطب الكهربائي للحصول على تسجيل للخلية الكاملة. إذا كانت الخلية التي تم تثبيت القطب عليها عبارة عن عصوية واردة، فسيتم ملاحظة عوابر سعوية صغيرة في وضع تسجيل الخلية الكاملة. يوضح هذا الشكل العابر النموذجي المسجل من ليفة واردة.

ابدأ بتسجيل النشاط المشبكي. إذا لم تظهر الليفة الواردة نشاطاً تلقائياً، فقم بإزالة استقطاب الخلية الشعرية عن طريق تطبيق محلول خارج خلوي بتركيز بوتاسيوم أعلى. يوضح هذا الشكل علاقات الجهد والتيار النموذجية للألياف AFF على اليسار والخلايا الشعرية الداخلية على اليمين.

سُجلت علاقات الجهد والتيار عند جهد تثبيت قدره -84 millivolts مع خطوات جهد تتراوح من -124 millivolts إلى +36 millivolts بزيادات قدرها 10 millivolt. تظهر قيم الجهد إلى يمين بعض المخططات التي تركز على علاقات الجهد والتيار من ليف وارد. يُلاحظ وجود التيارات بعد التشابكية الاستثارة أو EPCs خلال معظم خطوات الجهد.

عكست تيارات ما بعد التشابك الاستثارة (EPCs) عند جهد موجب قدره حوالي 6 millivolts. تم إجراء هذا التسجيل في وجود سم التت رودوتوكسين (tetrodotoxin) لحجب تيارات الصوديوم المعتمدة على الجهد؛ فبدون هذا الحاجب، كانت ستظهر تيارات صوديوم داخلية سريعة التنشيط في التسجيل، مما يجعل التسجيل يُصنف على أنه تسجيل لألياف واردة. لاحظ التيار الداخلي بطيء التنشيط عند جهود فرط الاستقطاب.

لا يتواجد هذا التيار في خلايا الشعر الداخلية أو الخلايا الداعمة، مما يعد مؤشراً جيداً على أن التسجيل صادر من ليف وارد. وتوضح هذه التسجيلات علاقات التيار والجهد لخلية شعر داخلية. ويشير السهم إلى تيارات البوتاسيوم الخارجة سريعة التنشيط عند الجهود الموجبة.

ويتبع ذلك تيارات بوتاسيوم مقومة متأخرة نتيجة لضيق قطر الماصة وارتفاع مقاومة الوصول. وتعتبر تيارات الخلايا الشعرية الداخلية الموضحة هنا أصغر من المتوقع للحصول على تسجيلات دقيقة لتيارات الخلايا الشعرية الداخلية، لذا يجب استخدام مصاصات ذات مقاومة وصول أقل.

ومع ذلك، فإن التسجيلات المعروضة هنا توضح إمكانية التمييز بوضوح بين علاقات الجهد والتيار في الخلايا الشعرية الداخلية والألياف الواردة. يوضح هذا الشكل التيارات المشبكية المسجلة من ليفة واردة. لاحظ التباين في حجم وشكل التيارات بعد المشبك الاستثارية (EPCs).

أُجريت التسجيلات في درجة حرارة الغرفة مع استخدام tetrodotoxin لحصر تيارات الصوديوم المعتمدة على الجهد. يوضح هذا الشكل تسجيلات متزامنة من خلية شعر داخلية وعصيب وارد متصل بها. استُخدمت خطوة جهد لإزالة استقطاب الخلية الشعرية الداخلية، وفي المقابل سُجلت تيارات كالسيوم داخلية من الخلية الشعرية الداخلية؛ حيث يؤدي تدفق الكالسيوم إلى إطلاق الناقل العصبي وتنشيط EPCs في العصيب الوارد.

ملاحظة، يظهر التثبيط التشابكي أثناء إزالة استقطاب الخلايا الشعرية الداخلية لمدة 50 millisecond عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء. ومن المهم تذكر توخي الحذر عند تشريح وتحضير أنسجة القوقعة، والتحلي بالصبر والتفاؤل عند محاولة التسجيل من النهايات العصبية الواردة.