الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات قدرة مقياس الطيف الفلوري F 7, 000 المزود بقارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader) على إجراء تقدير كمي للحمض النووي DNA مزدوج السلسلة باستخدام صبغة Pico green. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير العينات والكواشف، وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إعداد الجهاز.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحميل العينات في قارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader). أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي إجراء قياس المعايير والعينات. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر منحنى معايرة خطي، والذي يمكن استخدامه لتقدير كمية الـ DNA مزدوج السلسلة في العينات المجهولة.

قم بتشغيل مقياس الفلورية Hitachi F 7, 000 Spectra للسماح لمصباح الزينون بالإحماء لمدة ساعة واحدة في برنامج Excel. أنشئ ملفاً يحتوي على المعايير وبيانات العينات واحفظه بتنسيق القيم المفصولة بفاصلة أو بصيغة CSV. لإعداد مقياس الفلورية أولاً، انقر فوق زر الطريقة (method) الذي يفتح نافذة طريقة التحليل.

في حقل القياس، اختر photometry من القائمة المنسدلة. انقر الآن على علامة تبويب quantitation. في حقل نوع التكميم، اختر wavelength للإشارة إلى أن قراءة الفلورة ستتم باستخدام طول موجي محدد.

بالنسبة لنوع المعايرة، اختر المرتبة الأولى (first order)، وبالنسبة لعدد الأطوال الموجية، اختر واحداً. أدخل نانوغرام لكل ميليلتر كوحدة للتركيز. تأكد من عدم تحديد مربعي المعايرة اليدوية (manual calibration) وإجبار المنحنى على المرور بنقطة الصفر (force curve through zero)؛ وبالنسبة لعدد الخانات بعد الفاصلة العشرية، اختر خانتين، وأدخل صفراً في حقل الحد الأدنى للتركيز، و10,000 في حقل الحد الأعلى للتركيز.

بعد ذلك، انقر فوق علامة تبويب الجهاز (instrument) وفي حقل وضع البيانات (data mode) اختر الفلورة (fluorescence). تحقق من أن حقل سرعة التقطيع (chopping speed) غير نشط لأنه يُستخدم فقط لقياسات الفسفرة (phosphorescence). في حقل وضع الطول الموجي (wavelength mode)، اختر WL fixed في حقل ex WL، وأدخل 480 nanometers في حقل EM WL.

أدخل 520 nanometers. اترك جميع الحقول الأخرى تحت EX و EM غير نشطة. اضبط كلاً من شق الإثارة (ex slit) وشق الانبعاث (EM slit) على 5.0 nanometers.

باستخدام القوائم المنسدلة، اترك المربع الموجود أمام حقل جهد PMT من 1 إلى 1000 فولت غير محدد. بالنسبة لجهد PMT، اختر 700 volts من القائمة المنسدلة. وأيضاً، اختر الرقم اثنين لـ auto statistic calc number، والرقم واحد لـ replicates، و0.1 seconds لـ integration time، والصفر لـ delay.

الآن افتح علامة تبويب المراقبة (monitor) واضبط الحد الأقصى لمحور الصادات (why axis max) على 10,000 والحد الأدنى لمحور الصادات (why axis min) على صفر. ثم حدد المربع الموجود على يسار خيار "معالجة البيانات بعد الحصول عليها" (open data processing after data acquisition)، وإذا لزم الأمر، حدد المربع الموجود على يسار خيار "طباعة التقرير بعد الحصول على البيانات" (print report after data acquisition) للحصول على تقرير يتم طباعته تلقائياً عند الانتهاء من القراءات. وأخيراً، لحفظ جميع المعايير المختارة في علامات التبويب المختلفة بنافذة طريقة التحليل، انقر فوق علامة التبويب العامة (general) واحفظها باسم ملف جديد في موقع محدد.

انقر على زر الموافقة لإغلاق هذه النافذة. بهذا يكتمل إعداد معاملات اختبار الجهاز. ولإعداد قارئ الأطباق الدقيقة، انقر على زر MPR لإظهار نافذة إعداد MPR في المقدمة.

أولاً، حدد الآبار الخاصة بالمعايير. على سبيل المثال، انقر فوق الموضع A1 واسحب الماوس حتى الموضع E1، ثم انقر فوق زر مجموعة المعايير.

سيؤدي هذا إلى تحديد المواضع التي ستُستخدم للمعايير كما هو موضح باللون الأخضر. بعد ذلك، حدد مواضع العينات. وبالمثل، انقر واسحب الماوس فوق المواضع المقابلة في اللوحة، ثم انقر على زر مجموعة العينات، والذي سيقوم تلقائياً بتظليل المواضع المحددة باللون الأصفر.

استمر في تكرار العملية نفسها لمواضع قياسات العينات المطلوبة. لتحميل معلومات المعايير والعينات في ملف المتغيرات المفصول بفاصلة الذي تم إعداده مسبقاً، انقر فوق علامة تبويب معلومات الفجوة (well information) في نافذة إعداد MPR.

حدد زر تحميل معلومات البئر (load well information) وستفتح نافذة مستكشف ويندوز (Windows Explorer) لتحديد ملف معلومات البئر بصيغة dot csv. بعد تحميل المعلومات، يجب أن تظهر النافذة على شكل جدول. من أجل تحضير محلول عمل من كاشف Pico green، أضف 50 µL من كاشف pico green بتركيز 200 X إلى 9.95 mL من محلول TE buffer.

لإعداد منحنى القياس standard curve، قم بتحضير تخفيفات تسلسلية من Lambda double stranded DNA في محلول TE buffer بتركيزات نهائية تتراوح من 1 إلى 100 nanograms per milliliter، ثم انقل بواسطة الماصة 150 microliters من كل معيار إلى الآبار المخصصة في طبق 96 well plate. بعد ذلك، انقل 150 microliters من كل عينة اختبار إلى الآبار المخصصة المقابلة في الطبق. الآن وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 150 microliters من محلول Pico green إلى كل بئر، ثم اخلط المحلول مع عينات DNA.

يتم تحضين الطبق برفق في منطقة مظلمة لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق حتى يكتمل التفاعل. انقر على زر شاشة عرض الـ MPR لإظهار نافذة إعداد الـ MPR في مقدمة الشاشة، ثم انقر على زر موضع التبادل. ستتحرك منصة حامل الطبق الدقيق نحو مقدمة الجهاز؛ افتح باب قارئ الأطباق الدقيقة وضع طبق الـ 96 بئرًا على منصة الحامل بحيث يكون البئر A1 متجهًا نحو المقدمة، ثم أغلق باب قارئ الأطباق الدقيقة.

انقر على زر الموضع الأولي لوضع الموضع A لأحد ألواح المعايرة الدقيقة في موضع القياس. انقر على زر عرض الشاشة لإظهار نافذة القياس في مقدمة الشاشة. انقر على زر القياس لبدء قياس المعايير والعينات المجهولة.

يتم تقييم منحنى المعايرة الجيد باستخدام المعلمات المختلفة التي يوفرها برنامج F 7, 000. على سبيل المثال، فإن منحنى المعايرة المثالي هذا الذي تم الحصول عليه لتقدير كمية DNA مزدوج السلسلة باستخدام صبغة Pico green لديه معامل تحديد محسوب قدره 0.99993. إن النظام عالي الإنتاجية الموصوف هو تجميع تسلسلي لتقنيات تشمل صبغة Pico Green، ومقياس طيف فلوري Hitachi F 7, 000 مزود بقارئ أطباق ميكروية (Microplate reader)، وبرنامج حاسوبي لأتمتة جمع البيانات وتخزينها وتحليلها وعرضها.

يمكن لمزيج من التقنيات القوية أن يلبي الحاجة المتزايدة لتحليل كميات صغيرة من الـ double stranded DNA بدقة.