استخدام الري بالتنقيط وتدفق مفاعلات الأقراص الدوارة ل المكورات العنقودية الذهبية التحليل بيوفيلم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنمية الأغشية الحيوية البكتيرية تحت قوة قص منخفضة أو متوسطة باستخدام إما مفاعل غشائي حيوي بنظام التدفق بالتنقيط أو مفاعل القرص الدوار. يتم تلقيح القسائم الموجودة في مفاعلات الغشاء الحيوي بالبكتيريا أولاً، ثم تُحضن عند 37 درجة Celsius للسماح للخلايا البكتيرية بالالتصاق بأسطح النمو. وبمجرد التصاق الخلايا بالقسائم، يبدأ تدفق أوساط النمو مما يولد قوة قص تعمل أثناء تطور الغشاء الحيوي.

يمكن بعد ذلك حصاد الأغشية الحيوية الناضجة لتحليلها وملاحظتها. ويمكن استخدام المجهر الإلكتروني الماسح لتحديد البنية الفائقة للأغشية الحيوية المتكونة. أنا Blaze Balls.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الخلايا التدفقية في إمكانية تحقيق إنتاجية عالية من الكتلة الحيوية وتكوين أغشية حيوية متعددة ومتطابقة بسهولة. ستقوم ريتشل ستيفنسون وكيللي شوارتز، وهما فنية وطالبة دراسات عليا من مختبري، بشرح هذا الإجراء. يتكون مفاعل الغشاء الحيوي ذو التدفق القطري من أربع حجرات تحتوي على منافذ إدخال لدخول الوسط الغذائي ومنافذ تدفق لخروج النفايات.

توجد داخل كل حجرة قسيمة قابلة للإزالة ينمو عليها الغشاء الحيوي. لتجميع مفاعل الغشاء الحيوي ذو التدفق القطري، ضع القسائم في كل حجرة متوازية وأحكم إغلاق أغطية الحجرات. قم بتعقيم المفاعل المجمّع بالإضافة إلى أنابيب المغذيات المتدفقة باستخدام الموصدة (Autoclave) لتعقيم النظام قبل الاستخدام.

قم أيضاً بتعقيم وسط نمو الغشاء الحيوي الرقيق بجهاز التعقيم البخاري (autoclave) لتلقيح مفاعل التدفق القطري المعقم. ضع الجهاز على سطح مستوٍ وقم بتثبيت خطوط التدفق الخارج. بعد ذلك، املأ كل غرفة بـ 10 milliliters من وسط نمو معقم قائم على مرق صويا تريبتيك، وأضف 100 microliters من staphylococcus aureus.

يتم استزراع المزرعة الليلية في نفس الوسط لكل غرفة على حدة. يوضع المفاعل الملقح في حاضنة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 18 ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح القسيمة. بعد فترة التحضين، يتم فك Clamp أنابيب التدفق ووضع المفاعل على قطعة خشبية مائلة بزاوية 10 degree بطريقة معقمة.

قم بتوصيل أنابيب المغذيات المتدفقة بزجاجة تحتوي على مرق مغذيات للتدفق المستمر. مرر خط الأنابيب عبر المضخة وقم بتحضير الأنابيب عن طريق تشغيل المضخة بالسرعة القصوى. بمجرد تحضير الأنابيب المتدفقة، أوقف المضخة وثبّت إبراً قياس 22 بطول بوصة واحدة في نهاية كل أنبوب.

امسح سدادة مدخل الغرفة بمسحة إيثانول وبطريقة معقمة. أدخل الإبر عبر سدادة المدخل. قم بتشغيل المضخة واسمح للوسط بالتقطير فوق القسائم.

بمعدل تدفق يبلغ حوالي 125 µL في الدقيقة، يجب أن يتدفق الوسط لأسفل من فتحة سدادة المدخل إلى فتحة المخرج. قم بتشغيل المفاعل بتدفق مستمر لمدة ثلاثة أيام، مع التحقق من المفاعل من حين لآخر للتأكد من التصريف السليم.

يتم التحقق من التصريف عن طريق الفحص البصري للغرف للتأكد من عدم تجمع الوسط في الغرف. وفي حالة تجمع الوسط، فإن الضغط على أنبوب التدفق سيؤدي عادةً إلى تعزيز التصريف الصحيح لحصاد الغشاء الحيوي، لذا يجب إيقاف المضخة وإزالة الإبر من المفاعل، ثم وضع المفاعل على سطح مستوٍ.

بعد ثلاثة أيام من التدفق المستمر، تظهر الأغشية الحيوية لبكتيريا staphylococcus aureus على شكل كتلة حيوية صفراء منتشرة على طول القسائم الملقحة. وتكشف صورة مجهرية إلكترونية ماسحة للغشاء الحيوي عن تغطية staphylococcus aureus للقسيمة في مجتمع غشاء حيوي مرتبط بالسطح. ومن أجل تقدير كمية الكتلة الحيوية التي تم الحصول عليها، استخدم ملقطاً معقماً لإزالة القسائم بطريقة معقمة، ثم اجمع البكتيريا باستخدام كاشطة خلايا، وانقلها بعد ذلك إلى أنبوب مخروطي يحتوي على خمسة milliliters من محلول PBS المعقم.

باستخدام مجانس الأنسجة، يتم تفكيك التكتلات البكتيرية حتى يتم الحصول على معلق متجانس. يتم قياس وحدات تكوين المستعمرات عن طريق زرع تخفيفات متسلسلة على أطباق agar triptych وتحضينها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ثم عد المستعمرات. يتكون مفاعل الغشاء الحيوي ذو القرص الدوار من جهاز chemostat يتم من خلاله ضخ وسط النمو.

قرص دوار مزود بقضيب نجمي و18 قسيمة مصممة لتناسب القرص الدوار. لتجميع المفاعل، قم أولاً بتركيب قسيمات القرص الدوار في الفتحات المخصصة لها في القرص الدوار. بعد ذلك، ضع القرص المحمل داخل دورق زجاجي سعة لتر واحد مزود بفتحة فائض، ثم أغلق المفاعل بسدادة مطاطية رقم 15 تحتوي على ثقب واحد لتدفق الوسط وثقب واحد للتهوية.

قم بتعقيم المفاعل المجمّع وأنابيب الإدخال باستخدام جهاز التعقيم (Autoclave) لتعقيم النظام. ولتلقيح المفاعل، املأ الكأس بـ 250 milliliters من وسط استزراع معقم وأضف 500 microliters من مزرعة overnight لبكتيريا staphylococcus aureus التي نمت في مرق triptych soy. ضع المفاعل على لوح تحريك مضبوط على 250 rotations per minute وحضنه overnight عند 37 degrees Celsius للسماح للخلايا بالالتصاق بالقسائم.

بعد التحضين طوال الليل، قم بتوصيل أنبوب الإدخال بالمنفذ الموجود في خزان الوسط وبالمضخة 연دية. قم بتشغيل المضخة واضبط معدل التدفق على 0.25 milliliters per minute. اترك المفاعل يعمل لمدة 24 ساعة عند 37 degrees Celsius لحصد الأغشية الحيوية الناتجة.

أوقف المفاعل وبطريقة معقمة، قم بإزالة القرص دون لمس الكوبونات. وباستخدام ملاقط معقمة، انزع الكوبونات واغمر كل واحدة منها بعناية في PBS معقم لإزالة البكتيريا الملتصقة بشكل ضعيف من أجل اختبار المركبات المضادة للميكروبات.

ضع القسائم بطريقة معقمة في آبار فردية من لوحة ذات 96 بئراً تحتوي على المركبات المراد دراستها. يتم تحضين اللوحة لمدة أربع ساعات عند 37 °C. ثم يتم نقل القسائم إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL تحتوي على PBS بتركيز 1×، وتشتيت الأغشية الحيوية باستخدام جهاز متجانس.

أخيرًا، يتم زرع التخفيفات التسلسلية للخلايا على وسط أغار مغذٍ لتحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات القابلة للحياة لكل عينة كما تم وصفه سابقًا. يوضح هذا الرسم البياني عدد الوحدات المكونة للمستعمرات في الأغشية الحيوية التي تم تحضيرها باستخدام مفاعل القرص الدوار وتعريضها لبيروكسيد الهيدروجين، مع القدرة على إنتاج ما يصل إلى 18 غشاءً حيويًا متطابقًا. إن استخدام مفاعل القرص الدوار يجعل هذه التقنية مثالية لاختبار المركبات المضادة للميكروبات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل أغشية biofilm الحيوية في مفاعل التدفق المقطر ومفاعل القرص الدوار. توفر هذه المفاعلات بدائل لأغشية biofilm الحيوية في خلايا التدفق وأطباق المعايرة الدقيقة، وهي مثالية عندما تكون هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الكتلة الحيوية للـ biofilm أو عند الرغبة في إجراء اختبارات مضادات الميكروبات على أغشية biofilm حيوية مستقرة.