تحت الجلد من العدوى المكورات العنقودية المذهبة المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص بقاء وانتشار بكتيريا Staphylococcus aureus المقاومة للميثيسيلين (MRSA)، بالإضافة إلى مستويات الكيموكينات والسيتوكينات في مواقع العدوى. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الفراء من ظهور الفئران لإتاحة منطقة واضحة للملاحظة. وكخطوة ثانية.

سيتم إعطاء بكتيريا MRSA في معلق للفئران عن طريق الحقن تحت الجلد بعد ثلاثة أيام من العدوى، ويمكن تقييم أمراض العدوى والتعداد البكتيري من خلال تحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات من متجانسات الأنسجة على أطباق الآجار. مرحباً، كيف حالكم؟ اسمي دي لوردون.

أنا باحثة ما بعد الدكتوراه. مرحباً، اسمي مارييل سانشيز. أنا طالبة دكتوراة وأنا أندريا هدى.

أنا باحث مشارك، ونحن جزء من مختبر جورج لي في قسم طب الأطفال بمركز سيدار سيناي الطبي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجال الطبي، مثل نمذجة العدوى الشديدة، بما في ذلك التهاب العضلات، والتهاب العضلات المتعدد، والتهاب اللفافة الناخر. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول حالات العدوى الطارئة والخطيرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على أنظمة أخرى مثل المكورات العقدية من المجموعة A وكائنات أخرى.

بالإضافة إلى ذلك، يمكننا دراسة وظيفة وإمراضية الكائنات الأخرى التي تسبب التهاب العضلات والتهاب العضلات المتعدد. وبشكل عام، قد يواجه الأفراد الجدد في هذا الإجراء صعوبة لأن أحد المنظمات العالمية لمناطق التجمع من طاقم العمل يتميز بقابلية عالية للطفرات. وإذا لم يتم اتخاذ الاحتياطات اللازمة، فقد تظهر البيانات التي تم جمعها تباينًا كبيرًا، مما سيؤدي إلى صعوبة في تفسير هذه البيانات.

لنبدأ الآن. في منشأة ذات مستوى سلامة بيولوجية ثاني (BSL 2)، قم بتحضير طبق آجار دم أغنام في وسط TSA وعروة تعقيم باستخدام كتلة تجميد. انقل مزرعة Mercer المخزنة من التخزين عند درجة حرارة -80 °C.

بعد ذلك، وباستخدام العروة المعقمة، افصل قطعة صغيرة من الثلج من المزرعة الأصلية وضعها على الطبق. وبمجرد الحصول على قطعة صغيرة من المزرعة الأصلية لسلالة Mercer، انقل المزرعة الأصلية فوراً إلى المجمد لتجنب ذوبانها، لأن التجميد والإذابة المتكررين سيؤديان إلى تلف المزرعة الأصلية. استخدم العروة لتخطيط الآجار لتسهيل نمو مستعمرات Mercer منفردة.

قم بحضن الطبق عند 37 درجة مئوية طوال الليل بدون مكمل CO2. في اليوم التالي، قم بتجهيز ووضع علامات تعريفية على كل من طبق blood agar جديد، وطبق TSA، وأنبوب snap cap سعة 15 milliliter يحتوي على 3 milliliters من THB.

استرجع طبق M SSA الذي تمت زراعته طوال الليل وافحص النمط الظاهري للتحلل الدموي للمستعمرات. وباستخدام عروة تعقيم، اختر مستعمرة ذات نمط ظاهري يتوافق مع المستعمرات التجريبية السابقة. قم بتلقيح وسط THB بالمستعمرة المختارة باستخدام طريقة التخطيط بنفس العروة.

تُحضن الصفيحة التي تحتوي على محلول THB عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل مع الرج بسرعة 220 دورة في الدقيقة. ستُستخدم هذه البكتيريا لتلقيح المزرعة المخصصة للإصابة تحت الجلد في الفئران في الخطوات اللاحقة. ضع صفيحة آجار الدم في الحاضنة أيضاً.

سيتم استخدام الطبق في صباح اليوم التالي للتأكد من أن النمط المظهري لتحلل الدم للبكتيريا في محلول THB يتطابق مع النمط المظهري للمستعمرة المختارة في الأصل. إذا لم يكن النمط المظهري لتحلل الدم متسقاً مع المستنبت الأصلي، فلا تبدأ التجربة. انقل الفأر إلى منصة وقم بحلاقة الفرو عن ظهره.

إذا كان الحيوان عدوانياً بشكل مفرط، قد يكون التخدير باستخدام isof fluorine ضرورياً. ضع حوالي 5 mm³ من كريم مزيل الشعر مثل NA على المنطقة المحلوقة. يمكن شراء NA من الصيدلية المحلية.

تأكد من شراء كريم إزالة الشعر الذي يحتوي على زيت الأطفال، لأن المنتج الخالي من زيت الأطفال سيكون محفزاً بشكل مفرط لجلد الفئران. اترك الكريم ليتفاعل على سطح الجلد لمدة دقيقة واحدة تقريباً، وأثناء فترة تفاعل كريم إزالة الشعر، قم بترطيب بضع مناشف ورقية بالماء المقطر المزدوج بعد مرور دقيقة. استخدم المناشف الورقية المبللة لمسح المنطقة المحلوقة وتنظيفها.

تأكد من خلو الجلد من كريم إزالة الشعر، ثم قم بتسخين مسبق لـ 10 milliliters من THB في أنبوب ذو غطاء لولبي سعة 50 milliliter عند درجة حرارة 37 degrees Celsius في حاضنة بكتيرية لمدة تتراوح من أربع إلى 10 ساعات. انقل 20 microliters من المزرعة البكتيرية التي نمت طوال الليل إلى THB المسخن مسبقاً. سيؤدي ذلك إلى تخفيف merc التي نمت طوال الليل.

معلق بنسبة 1 إلى 500. يوضع الأنبوب عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة هزازة بسرعة 220 دورة في الدقيقة لمدة تتراوح تقريباً بين ساعتين ونصف إلى ثلاث ساعات بعد فترة التحضين. يتم استخدام المزيد من وسط THB لتخفيف المعلق البكتيري بشكل إضافي إلى نسبة 1 إلى 10، ثم يتم قياس المعلق باستخدام جهاز spectrophotometer.

مع قياس الامتصاصية عند 514 nanometers. استمر في تحضين المعلق عند 37 degrees Celsius مع الرج بسرعة 220 rotations per minute حتى تصل قيمة الامتصاصية للمعلق المخفف بنسبة 1:10 إلى 0.25. ولجمع الـ M er، يتم طرد أنبوب الـ 50 milliliter مركزياً عند 3,225 ×g لمدة 10 minutes عند four degrees Celsius، ثم يتم التخلص من supernatant Resus.

قم بتعليق الراسب البكتيري في 10 milliliters من DPBS واغسل البكتيريا مرة أخرى عن طريق تكرار خطوة الطرد المركزي لنموذج العدوى الشديدة هذا. أعِد تعليق الراسب البكتيري في حوالي one milliliter من DPBS لينتج عن ذلك حوالي 1 × 10¹⁰ colony forming units per milliliter. جهز أطباق sheep blood A-R-T-S-A وقم بتخفيف البكتيريا تسلسلياً من 10¹ إلى 10⁸ في أطباق DPBS.

ضع قطرات بحجم 10 µL من المعلق البكتيري المخفف تسلسلياً على طبق أغار دم في ثلاث مكررات. حضن الأطباق عند 37 °C طوال الليل. بعد تحضين الأطباق لمدة تتراوح من 16 إلى 18 ساعة، لاحظ وسجل النمط الظاهري لتحلل الدم للملقح.

قم بعدّ الوحدات المكونة للمستعمرات على الأطباق. سيتم حساب اللقاح المعدي بناءً على عدد الوحدات المكونة للمستعمرات على الأطباق.

قم بتجهيز حقنة تحتوي على 100 µL من المعلق البكتيري في DPBS الذي تم تحضيره مسبقاً. قبل الحقن، يجب تخدير الفئران بحيث يصبح معدل تنفسها حوالي مرة واحدة في الثانية. ولأغراض العرض التوضيحي، يظهر في هذا الفيديو فأر تم القضاء عليه رحيماً.

قم بحقن M ser في أحد الجانبين بعد الحقن. ثم انقل الفأر مرة أخرى إلى قفصه. راقب الحيوانات لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ساعات بعد الحقن للتأكد من أن الفأر على قيد الحياة قبل نقله مرة أخرى إلى غرفة الحيوانات.

راقب الآفات الموجودة على ظهور الحيوانات يومياً بعد التضحية بالحيوانات. قم بقياس وتسجيل حجم وحالة الآفات على الجلد. يتم تقدير كمية مساحات الآفات الجلدية والعضلية من خلال ضرب طول الآفة في عرضها بالملليمتر.

يجب تقسيم الآفات غير منتظمة الشكل إلى قطع متماثلة أصغر حجماً وقياس كل قطعة باستخدام نفس الطريقة. قم بتجهيز أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter تحتوي على 100 microliters من DPBS لجمع الأنسجة. اصنع شقاً في الجلد باستخدام شفرة حلاقة معقمة واستأصل الآفة باستخدام مقص معقم.

عند استئصال الآفة، تأكد من استئصال ما يقرب من 2 إلى 5 ملم من الجلد السليم المحيط بالمنطقة أيضاً. ضع الآفة في أنابيب جمع الأنسجة لتحليل آفات العضلات. قم بإزالة الجلد بعناية لقياس الحجم وتسجيل حالة الآفة الموجودة على النسيج العضلي.

قم بجمع الطحال والكليتين. ضع هذه الأنسجة في أنابيب جمع منفصلة لكل منها. قم بتجنيس الأنسجة عن طريق التقليب باستخدام حقنة سعة 1 mL لمدة 30 ثانية تقريباً.

أضف 900 µL من DPBS إلى كل أنبوب. قم بتجميع أطباق THA وقم بمزج عينات الأنسجة المتجانسة باستخدام جهاز الـ vortex لمدة خمس دقائق. قم بتخفيف العينة تسلسلياً.

تميل المعلقات إلى التخفيف بمقدار 1 إلى 10⁶. في أطباق ذات 96 بئراً، قم بتوزيع 10 µL من كل معلق مخفف تسلسلياً في الأطباق. حضن الأطباق في حاضنة بكتيرية عند 37 °C طوال الليل.

في صباح اليوم التالي، قم بعدّ الوحدات المكونة للمستعمرات من الأطباق واحسب عدد الوحدات المكونة للمستعمرات بناءً على عوامل التخفيف. إذا تمت عملية العدوى بشكل صحيح، سيُلاحظ ظهور فقاعة على سطح الجلد مباشرة بعد الحقن تحت الجلد. أما إذا لم تُلاحظ أي فقاعة، فقد يكون الحقن عميقاً جداً، مما قد يؤثر على نتيجة العدوى.

يمكن تقييم حجم الآفة وبقاء البكتيريا على قيد الحياة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة بـ MSA. تم فحص الآفات الجلدية التالية في اليوم الثالث بعد الإصابة، وهي تمثل أمثلة لآفة في فأر من سلالة CD1 مصاب في أحد الجانبين بـ 1×10⁷ colony forming units. وعادةً ما توجد الآفات العضلية في الأنسجة الموجودة أسفل الآفات الجلدية.

فيما يلي أمثلة على الآفات السطحية العضلية المتزامنة مع صور الآفات الجلدية المعروضة سابقاً. هذه آفات عضلية لوحظت في اليوم الثالث بعد العدوى في فأر مصاب بـ 1×10⁷ وحدة تشكيل مستعمرة. يتم تحديد مساحة الآفة بأنها الطول مضروباً في العرض للآفة مقاساً بالمليمترات، ويمكن قياسها لتقييم تلف أنسجة الجلد.

يمكن تقدير عدد الوحدات المكونة للمستعمرات للبكتيريا المتمركزة في موقع العدوى من خلال الآفات المستأصلة. ويمكن أن يشير تعداد الوحدات المكونة للمستعمرات إلى ما إذا كان عامل الضراوة يمنح بكتيريا MSA ميزة للبقاء على قيد الحياة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام احتياطات السلامة القياسية نظرًا لاستخدام الإبر والميكروبات شديدة الإمراض عند اتباع هذا الإجراء.

وأخيراً، يمكن استخدام نموذج الخراج الذي استخدمنا فيه جرعة لقاح أقل بـ 1,000 ضعف مقارنة بنموذجنا للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هي العوامل S التي تعزز عدوى RSA المستمرة؟ لا تنسَ أن العمل باستخدام محاقن مملوءة بـ Mars A يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ومن الضروري اتخاذ احتياطات مثل التخلص من المحقنة مباشرة في حاوية الأدوات الحادة، حيث من المهم تجنب الوخز العرضي بالإبرة. أيضاً، من المهم في هذه التجربة اتباع بروتوكولات BSO2 القياسية لضمان التطهير السليم لمنطقة العمل.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة. مرحباً. مرحباً، وداعاً.