وهو أداة تحليلية للعلبة التقييم الشامل الكيمياء الحيوية ، والهيكلية والأغشية الحيوية عن طريق الفم من Transcriptome بوساطة العقديات الطافرة

تتميز الغشاء الحيوية (Biofilms) المتكونة على أسطح الأسنان بكونها معقدة للغاية وذات بنية منظمة، حيث تترابط المجتمعات الميكروبية داخل مصفوفة خارج خلوية، وتتعرض لتحديات بيئية مستمرة. الهدف العام هنا هو استعراض مكونين محددين من مجموعة أدوات تحليلية صُممت لتسهيل الدراسات البنيوية والجزيئية، مع مراعاة الطبيعة المعقدة للأغشية الحيوية الفموية من خلال الجمع بين تقنية حديثة للتصوير الفلوري وبرمجيات مخصصة لمعالجة البيانات وتحليلها.

يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق اختيار اختبارات محددة لتحليل الغشاء الحيوي (biofilm)، والمخطط النسخي (transcriptome)، والبنية، بما في ذلك نهج تصوير بؤري جديد للتصور المتزامن للمواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) والبكتيريا. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في جمع البيانات الخام من المقايسات الحيوية. أما الخطوة الثالثة فهي معالجة البيانات الخام باستخدام برمجيات محددة، بما في ذلك برنامج duo stat المطور حديثاً لتحليل التوضع المشترك (colocalization analysis).

تتمثل الخطوة النهائية في تحليل بيانات العملية، بما في ذلك استخدام برامج تنقيب وتنظيم بيانات المصفوفات الدقيقة مثل microarray, data visualizer، أو MDV. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح كيف تغير المسببات المرضية الفموية نسخها الوراثية وبنية الغشاوات الحيوية استجابةً للنظام الغذائي المعقد والتفاعلات الميكروبية للمضيف باستخدام مجموعة أدواتنا التحليلية المتكاملة والفريدة، مما يوفر تحليلاً وتفسيراً أكثر شمولاً للبيانات الخاصة بالغشاوات الحيوية. مرحباً، اسمي ميشيل كو، أستاذ مشارك في مركز البيولوجيا الفموية هنا في المركز الطبي بجامعة روتشستر.

نقدم اليوم مجموعة أدوات تحليلية لتحليل الغشاء الحيوي. يمكن لهذه المجموعة المساعدة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث الأغشية الحيوية، مثل كيفية هيكلة خلايا الغشاء الحيوي، وترتيبها مع المصفوفة خارج الخلوية، وكيفية استجابتها للتحديات البيئية المعقدة على المستوى الترانسكريبتومي. اسمي جان، وأنا زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور Ks.

سأقوم اليوم باستعراض جزء التصوير من مجموعة الأدوات الخاصة بنا. مرحباً، أنا آيس كلين، أستاذ مساعد للبحث في مختبر الدكتور كي.

سأقدم اليوم برنامج MDV لتحليل بيانات مصفوفات القياس الدقيقة. في هذا الإجراء، تُستخدم أقراص الهيدروكسي أباتيت المطلية باللعاب كبدائل لسطح الأسنان التي تُنمى عليها الأغشية الحيوية. أولاً، أضف 2.8 milliliters من الوسط الزرعي الملقح بـ S mutants في كل بئر من طبق يحتوي على 24 بئراً، مع حماية الطبق من الضوء، ثم أضف صبغة LOR 6 47 المقترنة بالديكسترين إلى كل بئر ليصل التركيز النهائي إلى 1 micromolar، وقم بعملية السحب والضخ بالمصّة عدة مرات لخلط الصبغة في الوسط الزرعي.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط معقم، اغمس أقراص الهيدروكسي أباتيت المعقمة والمطلية باللعاب واغسلها مرتين في محلول AB buffer معقم لإزالة أي لعاب زائد أو مكونات لعابية غير مرتبطة. ثم ضع الأقراص رأسيًا في وسط زراعي مدعم بالصبغة، مع التأكد من غمر كل قرص بالكامل. غطِّ الطبق بورق ألومنيوم واتركه في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C في بيئة تحتوي على 5% carbon dioxide لمدة 20 ساعة للسماح بتكوين الغشاء الحيوي ودمج النسيج المقترن في السكريات المتعددة الخارجية التي تنتجها الخلايا البكتيرية.

لتوسيم الخلايا البكتيرية أولاً، قم بتجهيز طبق يحتوي على 24 بئراً بوضع 2.8 milliliters من مياه milli Q المعقمة في كل بئر. أضف 1.5 microliters من صبغة cyto nine إلى كل بئر للوصول إلى تركيز نهائي قدره one micromolar مع حماية الطبق من الضوء. وبمجرد تشكل الغشاء الحيوي، قم بإخراج الطبق الذي يحتوي على الأقراص من الحاضز.

اغسل كل قرص في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.89%. ثم انقل الأقراص إلى الصفيحة الجديدة التي تحتوي على صبغة cyto nine. غطِّ الصفيحة بورق ألومنيوم واتركها للحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد صبغ الخلايا، اغمر الأغشية الحيوية واغسلها بمحلول sodium chloride كما سبق. ثم باستخدام الملقط، حرر الأغشية الحيوية من السلك في طبق بتري يحتوي على sodium chloride. غلف طبق بتري بورق الألومنيوم.

أصبحت الأغشية الحيوية الآن جاهزة للتصور بواسطة المجهر البؤري باستخدام مجهر بؤري ماسح بالليزر. امسح كل غشاء حيوي في خمس إلى 10 مواضع مختارة عشوائياً وقم بتوليد سلسلة Z في كل موضع. وللسماح بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، افتح الصور البؤرية وقم بمعالجتها باستخدام برنامج مرآة (mirror software).

يُظهر هذا التصوير ثلاثي الأبعاد لصور مجهرية بؤرية (confocal images) تم إنتاجها باستخدام برنامج Amira، غشاءً حيويًا (biofilm) من طفرات S تشكل على سطح غير مبالٍ باستخدام الإجراء الموضح. تظهر الخلايا البكتيرية والمستعمرات الدقيقة باللون الأخضر وهي مدمجة في مصفوفة الغشاء الحيوي التي تحتوي على عديدات السكر الخارجية (exo polysaccharides). وباللون الأحمر، يمكن إنشاء عرض مقرب لمنطقة مختارة، مما يوضح العلاقة التركيبية المحددة بين البكتيريا وEPS على المقياس المجهري.

استخدم برنامج duos stat لتقدير كمية التوضع المشترك لمكونات الغشاء الحيوي المنفصلة، مثل البكتيريا والسكريات المتعددة الخارجية. أولاً، قم بتعيين مسار برنامج duo stat المطور حديثاً في إصدار MATLAB 5.1 وافتح مجلدات الصور التي تحتوي على صور السلسلة Z للمكونين المكونين للغشاء الحيوي. بعد ذلك، اختر قناتين ليتم ربطهما وتحليلهما.

يجب أن تمتلك مجموعتا الصور المتراكمة أحجام بكسل متطابقة في جميع الأبعاد ونفس عدد الصور في كل مجموعة. قم بتحديد عتبات كل قناة واتبع التعليمات الموجودة في واجهة البرنامج وأدخل البيانات في ملف معالجة البيانات لإجراء التحليل. يوضح هذا الشكل كيف يقوم duo stack بتفسير العلاقة المكانية بين البكتيريا وDBS كمياً.

يقوم برنامج Duo stack، ضمن الغشاء الحيوي (biofilm)، بحساب التوزيع الرأسي للبكتيريا والمواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) من سطح القرص إلى الطور السائل، كما يظهر هنا في الخط الأخضر للبكتيريا والخط الأحمر لـ EPS. كما يقوم بحساب التموضع المشترك للبكتيريا و EPS عبر سمك الغشاء الحيوي. وكما يظهر في الخط الأصفر، تشير البيانات إلى وجود نسب أعلى من EPS مقارنة بالبكتيريا عبر عمق الغشاء الحيوي، كما أن معظم الخلايا البكتيرية مرتبطة بـ EPS، خاصة من الطبقات الوسطى فما فوق. يوفر برنامج Duo stat مع التصوير ثلاثي الأبعاد فهماً معززاً للتنظيم الهيكلي والتفاعل بين البكتيريا و EPS في الأغشية الحيوية.

لضمان الحصول على RNA عالي الجودة من الأغشية الحيوية، نوصي بإجراء استخلاص RNA وفقاً للبروتوكول الخاص بالأغشية الحيوية والموصوف في المقالة التي نشرها Curian KU عام 2007. وفي هذه المجلة، تُستخدم البروتوكولات القياسية للكيمياء الحيوية التحليلية لتحضير مصفوفات cDNA الدقيقة واختبارات PCR الكمية في الوقت الحقيقي. ولتسهيل تحليل مجموعات البيانات الضخمة الناتجة عن تجارب المصفوفات الدقيقة، صممنا برنامجاً لتنظيم وتنقيب البيانات، وهو برنامج تصور بيانات المصفوفات الدقيقة أو MDV، والمتوفر عبر الإنترنت على الرابط www.oralgen.anl.gov.

قبل إرسال البيانات إلى MDV، قم بإجراء تحليل إحصائي مثل اختبار T المقترن (paired T-test) مع نموذج تباين عشوائي باستخدام برنامج BRB array tool المتاح عبر الإنترنت، مع تحديد قيمة P قصوى تبلغ 0.001 لمقارنة الفئات. في هذا المثال، تم إجراء تحليل لـ s mutton's، والأغشية الحيوية (biofilms) التي نمت في ثلاثة تركيزات سكر مختلفة وأربع نقاط زمنية. تم إجراء مقارنات مقترنة نتج عنها ثلاثة ملفات BRB: الحالة a (0.5% sucrose بالإضافة إلى 1% starch مقابل 1% sucrose)، والحالة B (0.5% sucrose بالإضافة إلى 1% starch مقابل 0.5% sucrose)، والحالة C (0.5% sucrose مقابل 1% sucrose).

تمثل هذه اللوحة عدد الجينات التي تم اكتشافها على أنها متباينة التعبير في كل حالة ونقطة زمنية تم تقييمها باستخدام مقارنة الفئات القياسية بواسطة أداة BRB array، وهو ما ينتج عنه عدد كبير من الجينات تسمى BRB raw data. ولتوضيح MDV، سنركز على النقطة الزمنية 30 hours باستخدام برنامج Excel. قم بتحويل BRB raw data إلى ملفات نصية محدودة بعلامات جدولة MDV tab limited text files.

تأكد من إزالة جميع الحروف التي تأتي مع رقم علامة موقع الجين، على سبيل المثال في الاسم SMU dot 1432 C. احذف الحرف C، ثم افتح برنامج MDV. افتح قائمة الملفات واختر "تحديد مصدر التعليقات التوضيحية" (select annotation source). اختر خيار "الملف المسطح" (flat file) عند ظهور مربع الحوار.

استخدم أزرار التصفح لاختيار الملفات التي تحتوي على تعليقات توضيحية لبيانات التصنيف الوظيفي لمسارات أرقام الأنطولوجيا الجينية وأسماء الجينات. انتقل إلى "ملف" (file) واستورد كل ملف من الملفات التي تم تحويلها إلى صيغة MDV. يمثل كل ملف حالة تجريبية.

قارن الجينات التي تم التعبير عنها في كل حالة تجريبية A مقابل B مقابل C. في هذا المثال، باستخدام ميزة مخطط فين. لهذا العرض التوضيحي، نركز على الجينات ذات التعبير المتباين المرتبطة بشكل فريد بتأثيرات السكروز والنشا مجتمعين. تُستخدم الميزة القائمة على مخطط فين لتصور عدد الجينات الفريدة والمشتركة التي تم التعبير عنها في ظل هذه الظروف المختلفة، وتساعدنا في تحديد الجينات التي سيتم اختيارها لمزيد من التحليل.

نقوم هنا باختيار الجينات ذات التعبير التفاضلي الفريدة في الحالة A و/أو B فقط، باستثناء تلك التي تم اكتشافها في C والموضحة باللون الرمادي هنا. لقد قلل برنامج MDV بشكل كبير من العدد الإجمالي للجينات المراد تحليلها، وفي الوقت ذاته قام بتصفية الجينات غير ذات الصلة بالحالة التجريبية. من قائمة الملف (file menu)، اختر خيار التصدير (export) لحفظ البيانات.

باعتبارها ملفات محددة بعلامات جدولة، يمكن فتح هذه الملفات في برنامج Excel حيث يمكن تنظيم مخرجات البيانات وتحويلها إلى العروض الرسومية المطلوبة. يتيح تنظيم البيانات في Excel العرض الرسومي لمخرجات MDV. يوضح هذا الرسم البياني نظرة عامة على التعبير التفاضلي لمجموعات فرعية وظيفية فريدة من الجينات التي تتأثر بمزيج النشا والسكروز في مراحل متميزة من تطور الغشاء الحيوي.

تكون التأثيرات على ترانسكريبتوم طفرات S أكثر وضوحاً عند 30 ساعة من تطور الغشاء الحيوي مقارنة بنقاط زمنية أخرى. وقد ساعدتنا هذه المخرجات في تحديد مجموعات فرعية وظيفية محددة بدقة من الجينات ذات الصلة بفرضية عملنا، مع مراعاة التأثيرات الزمنية التي سهّلت عملية اختيار الجينات والتحقق اللاحق منها. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن أيضاً إجراء طرق كيميائية حيوية وبروتيومية للإجابة على أسئلة إضافية مثل ماهية الاستجابات الفسيولوجية والأيضية المحددة للكائنات الحية داخل الأغشية الحيوية.

من شأن مثل هذا التحليل الشامل والمتكامل أن يساعد بالتأكيد في تعميق فهم كيفية تأثير الغشاء الحيوي الرقيق على القدرة الإمراضية داخل التجويف الأنفي، وهو بيئة ديناميكية ومعقدة للغاية. لمزيد من التفاصيل، يرجى مراجعة ملف PDF المرفق بهذا المقال المرئي.