استخدام إنتاجية عالية في المختبر نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أغشية حيوية متعددة الأنواع من البلاك الأسنان. بالتوازي مع التحليل ، يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء وسائط تمثيلية وتلقيح أولا. ثم يتم إدخال اللقاح إلى رقاقة الموائع الدقيقة بعد حضانة ليلية ، ويتشكل غشاء حيوي داخل القناة الدقيقة.

أخيرا ، يتم غسل الأغشية الحيوية وتلطيخها في الموقع لاثنين من المجهري المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر أو الفحص المجهري الفلوري epi. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل خلايا التدفق هي أنها نظام إنتاجية عالية يسمح بإجراء تجارب متعددة بالتوازي مع استخدام مواد أقل وعدم الحاجة إلى وسائط معملية اصطناعية. للبدء ، جمع عينات اللعاب من مجموعة من خمسة متطوعين أو أكثر في أنابيب بلاستيكية فردية سعة 50 مل.

اسحب عينات اللعاب إلى دورق بلاستيكي واحد يوضع على الثلج. تجنب استخدام أكواب الزجاج في هذا الإعداد لأن البوليمرات الحيوية للعاب تميل إلى الالتصاق بالأسطح الزجاجية. بعد ذلك ، أضف ثقب dithio threes إلى العينة حتى يصبح تركيزها النهائي 2.5 مللي مولار.

قلب الخليط لمدة 10 دقائق على الثلج. اسحب جميع المحتويات إلى عدة أنابيب بلاستيكية. قم بإجراء دوران عالي السرعة لمدة 30 دقيقة في جهاز طرد مركزي مبرد بأربع درجات مئوية لفصل الجسيمات عن العينة.

انقل اللعاب إلى وعاء طازج ومعقم وتخلص من جزء الحبيبات لتحضير وسط نمو خال من البكتيريا من العينة. أولا ، قم بتخفيف عينة اليوم الخالية من الحطام بثلاثة أحجام من الماء منزوع الأيونات. ثم باستخدام مرشح غشاء ربط منخفض البروتين 0.22 صغير.

عقم اللعاب مع الحفاظ على الجزء المصفى المبرد على الجليد. بليغ المحلول المعقم وتخزينه على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة. اجمع عينات اللعاب من مجموعة مكونة من خمسة متطوعين أو أكثر في أنابيب بلاستيكية معقمة سعة 50 ملليلترا.

اسحب عينات اللعاب إلى دورق بلاستيكي معقم مسبقا بدرجة حرارة الغرفة ، أو أنبوب سعة 50 مل. أضف الجلسرين المعقم حتى 25٪ جلسرين. تم الوصول إلى خليط اللعاب بنسبة 75٪.

على عكس بروتوكول وسط النمو حيث تمت إزالة الملوثات بخطوة ترشيح ، فإن التقنية المعقمة مهمة هنا لمنع التلوث من البكتيريا أو الفطريات غير الفموية. اخلطي محلول الجلسرين اللعاب. حسنا ، قم بتخزين خليط الجلسرين اللعاب وتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة للبدء.

قم بشراء أو تصنيع شريحة مائع دقيقة ذات قناة دقيقة مماثلة لتلك المبينة هنا قبل تلقيح العينات في الرقاقة لكل من وسط النمو السلبي للبكتيريا واللقاح الإيجابي للبكتيريا على المقعد في درجة حرارة الغرفة. دوامة كل أنبوب لمدة خمس ثوان للخلط قبل الشروع في التجربة الرئيسية ، ابدأ بإضافة 100 ميكرولتر من وسط النمو في خزان مخرج الرقائق الدقيقة. باستخدام مضخة التحكم بالكمبيوتر ، ابدأ التدفق المتوسط عبر القناة الدقيقة لمدة دقيقتين.

في درجة حرارة الغرفة ، افحص كل قناة بصريا لضمان ملء السوائل بشكل مناسب. احتضن الرقاقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. سيؤدي ذلك إلى تغطية الجدران الجانبية للقناة الدقيقة بسقالة بوليمر حيوي يرتكز عليها الأغشية الحيوية أثناء النمو.

ثم قم بسحب الوسائط أو الوسائط المتبقية يدويا من خزان المخرج ونقل هذا الكسر ، والذي سيعمل الآن كحمل موازنة هيدروديناميكي إلى خزان المدخل. بعد ترسيب سقالة البوليمر الحيوي ، أضف 100 ميكرولتر من اللقاح الإيجابي للبكتيريا إلى خزان المخرج. ضع الرقاقة على لوح تسخين 37 درجة مئوية وابدأ التدفق العكسي للقص المتوسط.

السفر من المخرج إلى خزان المدخل لمدة ست ثوان بالضبط. ثم قم بإيقاف تشغيل المضخة واحتضان الشريحة في ظل ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتسهيل ربط البكتيريا أو الفطريات بالجدران الجانبية للقنوات الدقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة وتخلص من جميع اللقاحات من خزان المخرج باستخدام ماصة وأعد ملء نفس الخزان عن طريق إضافة ملليلتر واحد من وسط النمو الخالي من البكتيريا.

احتضان الرقاقة الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة تقريبا تحت تدفق منخفض لتعزيز نمو الأغشية الحيوية داخل القناة عند النمو بين عشية وضحاها. ماصة جميع المحاليل من كل من خزانات المدخل والمخرج. ضع 100 ميكرولتر من PBS في خزان المدخل واغسل القناة الدقيقة لمدة 20 دقيقة.

في ظل التدفق الأمامي المنخفض من المدخل إلى المخرج ، أصبح الفيلم الحيوي جاهزا الآن للتلطيخ الحي الميت. قبل تلطيخ الأغشية الحيوية مباشرة ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من مزيج تلوين الجدوى كما هو موجود في بروتوكول النص لكل قناة سيتم تلطيخها. قم بحماية هذا المحلول من التعرض للضوء حتى تكون هناك حاجة لتلطيخ الأغشية الحيوية ، واستنشاق كل السوائل المتبقية من المدخل وإعادة ملء نفس الخزان ب 100 ميكرولتر من مزيج تلطيخ الجدوى.

ثم ادفع محلول التلوين عبر القناة الدقيقة لمدة 45 دقيقة. تحت تدفق المشاركة المنخفض في درجة حرارة الغرفة ، تأكد من حماية الرقاقة من التعرض للضوء. قم بشفط كل السوائل المتبقية من خزان المدخل وأعد تعبئتها ب 100 ميكرولتر من PBS.

اغسل القناة الدقيقة لمدة 20 دقيقة تحت تدفق منخفض للمشاركة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأصباغ الزائدة غير المرتبطة. أصبح الأغشية الحيوية الملونة جاهزة الآن للفحص المجهري الفلوري لفحص الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية. يمكن استخدام عمليات إعادة البناء الرقمية باستخدام عمليات المسح الأفقية باستخدام المجهر متحد البؤر لعرض الهيكل الكلي للفيلم من أي زاوية مائلة.

علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق تحليل تلطيخ الميت الحي على نفس مجموعة بيانات البيانات لدراسة الاعتماد المكاني لبقاء الخلية داخل الأغشية الحيوية كدالة للمعالجات الكيميائية المختلفة. بمجرد تصوير الأغشية الحيوية ، يمكن استخراج الخلايا من القنوات غير الملطخة. باستخدام الماء المقطر الذي يعمل بتدفق قص عال ، يمكن بعد ذلك التعرف على فلورا الأغشية الحيوية من الحمض النووي الجيني عن طريق تسلسل 4 5 4 بايرو.

باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل إضافة أنواع أو مركبات مختلفة من أجل الإجابة على أسئلة مختلفة مثل ما يحدث للأغشية الحيوية متعددة الأنواع في ظل ظروف مختلفة.