الخرز وفصل الخلايا في أجهزة ميكروفلويديك متعدد القنوات باستخدام Dielectrophoresis وتدفق رقائقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم في الخلايا والخرزات داخل أجهزة الموائع الدقيقة باستخدام الرحلان الكهربائي العازل (DEP) عن طريق لوحات الدوائر المطبوعة (PCBs). ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تصميم وتجهيز أقطاب لوحة الدوائر المطبوعة وقنوات الموائع الدقيقة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تجهيز مجموعة الموائع الدقيقة الخاصة بلوحة الدوائر المطبوعة ومحاليل الخرزات والخلايا.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في ملء القنوات بوسط ذو موصلية منخفضة، ثم تحميل الخرزات والخلايا. والخطوة النهائية من الإجراء هي توصيل مجموعة لوحة الدائرة المطبوعة (PCB) بمضخم القدرة ومولد الدوال، ثم بدء عملية DEP. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر فصل ومعالجة الخلايا والخرزات في الأجهزة الموائع دقيقة (microfluidic devices) من خلال استخدام DEP.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن المستخدم يجب أن يستوعب مبادئ DEP من أجل تطوير قطب كهربائي فعال يعمل مع جهاز ميكروفلويديك للتحكم في الخلايا أو الحبيبات المطلوبة. ومن ناحية أخرى، فإن استخدام لوحات الدوائر المطبوعة (PCBs) كأقطاب كهربائية يجعل عملية تحفيز الخلايا والحبيبات في أجهزة الميكروفلويديك متاحة لمجموعة متنوعة من التخصصات العلمية. تتمثل الخطوة الأولى من هذا الإجراء في تصميم لوحة الدوائر المطبوعة أو أقطاب PCB بحيث تمتلك الهندسة المطلوبة لتوليد مجال كهربائي غير منتظم.

عند اكتمال التصميم، اطلب رقائق أقطاب PCB المخصصة من خلال منشأة تصنيع تجارية. بعد وصول لوحة PCB المصنعة حسب الطلب، افتحها وافحصها لهذا العرض التوضيحي. يبلغ طول لوحة PCB ‏8.4 centimeters وعرضها 2.1 centimeters.

يبلغ عرض الأقطاب الكهربائية المعدنية خمسة مليمترات. في هذا المثال، تتكون الأقطاب من شريطين معدنيين طويلين ومنطقتين متقاطعتين بطول 4.5 مليمتر حيث تتداخل الأقطاب كهربائياً. تولد هذه المناطق المتداخلة مجالاً كهربائياً قوياً غير منتظم لإنشاء اتصال من المحفز إلى قطب لوحة الدوائر المطبوعة (PCB).

ضع سلكاً بقياس 16 gauge على طرف القطب الكهربائي. استخدم مكواة لحام ساخنة لتثبيت السلك في مكانه على المنطقة المعدنية من لوحة الدائرة المطبوعة (PCB). يؤدي ذلك إلى تسخين السلك.

ثبّت سلك اللحام على السلك المُسخن واسمح لكمية صغيرة من اللحام بالتدفق إلى السلك. بعد أن يمتلئ السلك باللحام، ارفع مكواة اللحام مع تثبيت السلك في مكانه حتى يبرد اللحام. كرر عملية اللحام للوصلة الكهربائية الأخرى على لوحة الدوائر المطبوعة (PCB).

تتمثل الخطوة التالية في تحضير قنوات مائعية دقيقة بنمط التفرع المطلوب. وباستخدام تقنيات التصنيع الدقيق القياسية، يتم إنشاء قالب رئيسي لتحديد القنوات باستخدام رقاقة سيليكون ومادة SU-8 المقاومة للضوء. يحتوي هذا القالب الرئيسي على قناة إدخال واحدة وثلاث قنوات مستهدفة.

يبلغ عرض القنوات 100 micrometers، وارتفاع القنوات 27 micrometers. بمجرد إنشاء القالب الرئيسي، اخلط بوليمر LAANE أو المطاط المرن PDMS مع عامل معالجة بنسبة وزنية قدرها 10 إلى 1 لمدة خمس دقائق. صب سائل PDMS فوق قالب SU eight الرئيسي المُعد مسبقاً، وأزل فقاعات الهواء عن طريق تعريض سائل PDMS للفراغ لمدة ثلاث دقائق.

كرر عملية التفريغ إذا لزم الأمر لإزالة جميع الفقاعات تماماً. يمكن استخدام تيار من غاز النيتروجين لإزالة الفقاعات الإضافية عند الحاجة. قم بمعالجة PDMS في فرن عند 70 درجة Celsius لمدة ساعتين.

استخدم شفرة حلاقة لإزالة رقاقة P-D-M-S-S التي تحتوي على القنوات الموائع دقيقة من الويفر. كن حريصاً على عدم كسر الويفر مع توجيه مساحة القنوات للأعلى. استخدم خرامة خزعات لثقب فتحات لإدخال السوائل والخلايا إلى جهاز الموائع الدقيقة. ثم قم بالتشذيب.

أي فائض من الـ PDMS. افحص الجهاز الموائع الدقيقة للتأكد من خلوه من الغبار والرواسب. استخدم شريط 3M Scotch Magic لتنظيف الـ PDMS.

عرض قنوات PDMS وشريحة غطاء نظيفة رقم صفر بسمك يتراوح من 80 إلى 130 ميكرومتر لغاز البلازما لمدة 1.5 دقيقة. أخرج مختبر PDMS وشريحة الغطاء من جهاز تنظيف البلازما في طبق بتري، ثم قم بربط قنوات PDMS الموائعية الدقيقة بالبلازما فوق شريحة الغطاء، وسخن مجمع القنوات الموائعية الدقيقة وشريحة الغطاء على لوح تسخين مضبوط عند 100 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. الخطوة الأخيرة في تحضير جهاز الموائع الدقيقة هي وضع قنوات PDMS وشريحة الغطاء فوق أقطاب لوحة الدائرة المطبوعة (PCB).

ابدأ بوضع 10 µL تقريبًا من الزيت المعدني على لوحة الدوائر المطبوعة (PCB). ولضمان الاتصال الوثيق بين لوحة الدوائر المطبوعة وغطاء الشريحة، ضع مجموعة القنوات الموائعية الدقيقة لغطاء الشريحة فوق لوحة الدوائر المطبوعة المزيّتة مع غطاء الشريحة. وبالتلامس مع الزيت، اضغط برفق على مجموعة القنوات الموائعية الدقيقة لغطاء الشريحة لضمان الاتصال الجيد وتقليل الفقاعات الهوائية التي قد تعيق رؤية الخلايا والخرزات.

تتمثل خطوة مهمة أخرى في تحضير خليط الوسط منخفض الموصلية، والذي يتكون من 8.5% sucrose و0.3% glucose (وزن إلى حجم) في ماء منزوع الأيونات. أصبح الجهاز الموائع الدقيقة الآن جاهزاً للاستخدام؛ وباستخدام ماصة، املأ كل قناة موائع دقيقة بـ 15 إلى 20 µL من الوسط منخفض الموصلية إذا لزم الأمر. استخدم الشفط بالتفريغ لإزالة أي فقاعات موجودة في القنوات.

تتمثل الخطوة التالية في إدخال الجسيمات الاختبارية إلى جهاز الموائع الدقيقة. يستخدم هذا العرض معلقاً يحتوي على 550 خرزة بوليسترين لكل ميكرولتر من وسط منخفض الموصلية؛ ونظراً لأن الخرزات قد تترسب بمرور الوقت، يجب إعادة تعليق الخرزات عن طريق الرج. بعد ذلك، وباستخدام ماصة، يتم إدخال 200 ميكرولتر من معلق خرزات البوليسترين في القناة.

تتمثل الخطوة التالية في تجهيز الأقطاب الكهربائية، وذلك بتوصيل مخرج مولد الدوال بمدخل مكبر قدرة التيار المتردد (AC power amplifier). بعد ذلك، يتم توصيل مخرج المكبر بأسلاك الأقطاب الكهربائية. قم بتغطية جميع الأسلاك الكهربائية وأسطح التجهيزات بشريط لاصق عازل لحماية المستخدمين من التعرض المحتمل لصدمات كهربائية.

اضبط مولد الدوال لإنتاج موجة جيبية بتردد يتراوح من 1 إلى 1.5 ميجاهرتز. ابدأ عملية DEP للبدء في فرز الخلايا والحبيبات في هذا الإعداد. تقع قناة الإدخال على اليمين، وتنفصل القنوات الثلاث المستهدفة عند الوصلة ثلاثية التشعب.

تتوافق أقطاب PCB مع الخطوط السوداء في غياب التدفق الصفائحي وغياب DEP. تكون الخرزات ثابتة أساساً عند بدء DEP، ولكن بدون تدفق. وتهاجر الخرزات نحو أقطاب PCB وبعيداً عن المساحة الموجودة بين الأقطاب عندما يكون التدفق الصفائحي مفعلاً.

ولكن عند إيقاف تشغيل DEP، تتوزع الخرزات المتدفقة عبر قنوات الإدخال بين القنوات المستهدفة الثلاث. وعند تفعيل DEP مع استمرار التدفق الطبقي، يتم توجيه الخرزات للتدفق فقط في القناة المركزية. وفي الفيديوهات التالية، تم تدوير الجهاز الموائعي الدقيق فوق أقطاب PCB، مما أدى إلى تغيير في اتجاه القنوات.

فيما يتعلق بأقطاب اللوحة المطبوعة (PCB). أصبحت قناة المدخل، التي كانت سابقاً متعامدة مع أقطاب PCB، الآن موازية تقريباً للأقطاب عند تشغيل التدفق الطبقي. ولكن عند إيقاف تشغيل DEP، تدخل الخرزات إلى القنوات الثلاث المستهدفة بالتساوي.

عند بدء عملية DEP، تقترب الخرزات من نقطة التشعب الثلاثي، حيث تسحب قوة DEP الخرزات إلى القناة الجانبية الموجودة فوق القطب الكهربائي. وتظهر مجموعة الصور التالية في الفيديو خليطاً من خلايا سرطان القولون الغدي البشري (HT 29) والخرزات الفلورية داخل الجهاز الموائع دقيقة القنوات. وفي صورة DIC هذه، يشير السهم المفتوح إلى اتجاه التدفق الصفائحي، بينما تم تحديد القنوات بخطوط متقطعة.

يمكن رؤية الأقطاب الكهربائية المعدنية العاكسة كشريط خلفية فاتح، ويُستخدم مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC microscopy) لتصوير الخرزات أثناء التوهج. تُستخدم صور كثافة المقياس لجعل الخلايا أكثر وضوحاً.

هذا الشكل هو نفس الصورة الموجودة في الشكل الآخر، باستثناء أنه معروض كصورة شدة بمقياس التوهج (glow scale)، وذلك لتصور الخلايا والخرز معاً. تظهر الأقطاب الكهربائية المعدنية العاكسة كخطوط صفراء وخضراء في هذا الشكل. مع استخدام DEP، يخرج الخرز من القناة اليمنى كما هو موضح في صورة DIC، بينما تخرج خلايا HT 29 من القناتين المركزية واليسرى كما هو موضح في صورة مقياس التوهج قبل بدء DEP. يتدفق محلول مختلط من الخلايا والخرز من قناة إدخال واحدة إلى ثلاث قنوات مستهدفة منفصلة.

بعد تحريض DEP، يتم تحريك الخرز والخلايا بشكل انتقائي إلى قنوات منفصلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية البدء في تنفيذ الرحلان الكهربائي القرصي لمعالجة الخلايا والخرز داخل الأجهزة الموائعية الدقيقة.