جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة

الهدف العام من الطريقة التالية هو تصوير سلوك الخلايا المفردة من سلالات مختلفة من الخميرة تحت نفس الظروف الديناميكية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع جهاز مائع دقيق مكون من طبقتين، حيث تحتوي الطبقة السفلية على كل سلالة من السلالات المختلفة بشكل منفصل، بينما توفر الطبقة العلوية ظروف التدفق الديناميكي كخطوة ثانية. يتم وضع سلالات الخميرة المختلفة في الآبار ثم يُغلق الجهاز، مما يؤدي إلى إنشاء قناة واحدة تحتوي على سلالات متعددة ومنفصلة.

بعد ذلك، نقوم بتصوير استجابات الخلايا للتغيرات الديناميكية في الوسط. ومن خلال التحكم في معدلات التدفق في مدخلي القناة Y، تظهر النتائج سلالات مختلفة خضعت لنفس الظروف الديناميكية دون حدوث تلوث خلطي بين الآبار. يتميز هذا الجهاز الموائع الدقيقة بعدة مزايا رئيسية مقارنة بالأنظمة الحالية الأخرى؛ حيث يتيح تصوير سلالات متميزة متعددة تحت نفس الظروف الديناميكية.

علاوة على ذلك، ومن المهم الإشارة إلى أنه يمكن تصنيعه بسهولة في أي مختبر دون الحاجة إلى معدات خاصة. وقد جاءت فكرة هذه الطريقة من مناقشة حول كيفية تتبع استجابات عزلات مختلفة من سلالات East البرية لدورات التجويع. في البداية، قم برسم أو طباعة المخطط المطلوب للقناة الدقيقة بمقياس رسم دقيق.

بعد ذلك، قم بتغطية شريحة زجاجية بطبقات من الشريط اللاصق. وللوصول إلى الارتفاع المطلوب للقناة، ضع تصميم المخطط على سطح مستوٍ ومحاذِ الشريحة فوق نمط التصميم. الآن، قم بقص الشريط اللاصق الموجود على الشريحة الزجاجية بعناية وفقاً للمخطط. ثم قم بإزالة الشريط اللاصق من جميع مناطق الشريحة الزجاجية.

يتم قبول تلك الموجودة في مخطط القناة الدقيقة. توضع الشريحة في فرن تسخين عند درجة حرارة 65 °C لمدة ثلاث دقائق، ثم تنظف بلطف باستخدام الإيثانول.

امزج المكون الأساسي وعامل المعالجة لـ PDMS وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. صب حوالي 30 milliliters من خليط PDMS في طبق بتري حتى يصل الارتفاع إلى 0.5 centimeters تقريباً. قم بإزالة الغازات من PDMS في الفراغ إذا لزم الأمر.

اغمر الشريحة الزجاجية في PDMS بحيث يكون الشريط اللاصق المنقوش موجهاً للأعلى. إن وضع النمط بعد PDMS يمنع تكون فقاعات الهواء بين الشريحة وقاع الطبق. اتركها لتتصلب لمدة 48 ساعة عند 65 درجة مئوية، مع التأكد من أن الطبق في وضع أفقي باستخدام ميزان تسوية الفقاعات في طبق بتري جديد بقطر 90 مليمتر. صب ثلاثة مليلتر من خليط PDMS.

يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام جهاز طلاء دوراني (spin coder) إذا كان متاحاً. يتم إجراء عملية إزالة الغازات (DGAs) والمعالجة كما هو موضح سابقاً. الآن، قم بقص طبقة التدفق لجهاز الموائع الدقيقة بعناية إلى الحجم المطلوب باستخدام خرامة خزعات (biopsy puncher).

قم بعمل ثقوب للمداخل والمخارج في طبقة التدفق. كما يجب قص طبقة آبار ذات حجم مماثل من طبق بتري الثاني ووضعها على لوح زجاجي سميك. ثم قم بإزاحة مخطط التصميم فوقها.

بعد ذلك، قم بتثقيب الآبار بما يتوافق مع القنوات الدقيقة الموجودة في المخطط باستخدام الإيثانول، ثم نظف كلتا طبقتي PDMS وشريحة الغطاء الزجاجية واتركهما لتجفا في الهواء. بعد ذلك، قم بمعالجة شريحة الغطاء الزجاجية وطبقة آبار PDMS إما باستخدام جهاز نقش البلازما القياسي للربط غير العكسي، أو باستخدام جهاز معالجة كورونا المحمول للربط العكسي. ضع طبقة الآبار بعناية فوق شريحة الغطاء لتحقيق الالتصاق.

مع فرك أي فقاعات هوائية برفق لإزالتها. قم بتحضير الأوساط المطلوبة في محاقن مناسبة ووصلها بأنابيب tigon الممررة عبر مضخة محاقن. لتصوير الخلايا.

استخدم القوى. انتقل إلى المرحلة المطلوبة، وقم برج المزرعة جيداً باستخدام جهاز Vortex، وانقل 300 µL إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة. ضع بلطف 1 µL من con canna A في كل بئر من طبقة آبار PDMS.

اغسل الفائض من con A من كل بئر مرتين عن طريق سحب الماء بلطف بالماصة أثناء جفاف con A. اغسل السلالات مرتين باستخدام 300 µL من وسط SC الخالي من الجلوكوز. يساعد غسل الجلوكوز المتبقي من جدران الخلايا على الالتصاق السليم بـ conval.

بعد الرج الدوامي، يتم سحب حوالي 0.5 µL من معلق الخلايا بدقة باستخدام الماصة وتوزيعها في آبار منفردة. تُغسل الخلايا المتبقية بلطف باستخدام وسط غذائي غني. يجب تنفيذ الخطوتين التاليتين بسرعة لمنع جفاف الخلايا.

كخطوة اختيارية، عالج الشريحة والآبار بالبلازما مع الحرص على عدم توجيه البلازما نحو الآبار مباشرة. بعد ذلك، وتحت المجهر المجسم، ضع الشريحة بعناية فوق الآبار مع إيلاء اهتمام دقيق للمحاذاة بينهما. اضغط بلطف لالتصاق طبقتي PDMS.

املأ الجهاز ببطء وبالكامل بنحو 50 microliters من الوسط الغني، مع التأكد من عدم ترك أي فقاعات هوائية داخل القناة. الآن قم بتوصيل الجهاز عن طريق إدخال الأنابيب في المداخل المناسبة وابدأ تدفق الوسط. احرص على عدم تكون فقاعات هوائية في الأنابيب لأنها قد تعلق داخل الجهاز وتؤدي إلى تعطيل التدفق.

باشر بوضع الجهاز تحت المجهر وتحديد نقاط التصوير المناسبة في كل بئر، مع الحفاظ على تدفق الوسط الغني فوق الخلايا لمدة ساعة واحدة أو لفترة أطول إذا لزم الأمر، وذلك للسماح لها بالتعافي.

ابدأ التجربة بضبط التدفق الثابت. اضبط المضخة A على 0.8 milliliters per hour والمضخة B على 0.2 milliliters per hour. بالنسبة للوسط، يجب أن يتدفق على أكثر من 80% من عرض القناة.

يمكننا تغيير الظروف في الجهاز ديناميكياً عن طريق تغيير معدلات التدفق النسبية. وتستقر الظروف الجديدة في غضون ثوانٍ على طول القناة بأكملها. ولتوضيح الفصل بين السلالات المختلفة، يتم تصوير سلالتين متمايزتين من الخميرة في آبار متبادلة.

لاحظ أنه لا يوجد تسريب للخلايا بين الآبار في هذه التجربة. كلا السلالتين لديهما عامل النسخ MSN2 المسمى بـ YFP لاختبار التأثير المتزامن للظروف المتغيرة ديناميكيًا. تم تغيير معدلات التدفق في قناتي الإدخال لإنشاء خطوة من الوسط الخالي من الغلوكوز.

أدى ذلك إلى تموضع MSN two في النواة. ومن المهم أنه يمكن تحليل المسار الزمني لمستويات MSN two YFP النووية في الخلايا المفردة. وبذلك، يمكن استخدام جهاز PDMS للموائع الدقيقة لتطبيق ظروف ديناميكية متزامنة على آبار متعددة.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم ترك الخلايا تجف أثناء تجميع الجهاز. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بسهولة دون الحاجة إلى الليثوغرافيا الناعمة.