ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف تعبير micro RNA بكفاءة وبتكلفة منخفضة وبأقل قدر من المواد البادئة، وذلك من خلال دمج تقنية multiplex quantitative R-T-P-C-R مع منصة مائعية دقيقة (microfluidic platform). يبدأ ذلك بتركيز الـ RNA المستخلص، يليه النسخ العكسي المتعدد (multiplex reverse transcription) والتضخيم المسبق المتعدد (multiplex pre amplification). وتتمثل الخطوة التالية في تنقية العينة للتخلص من البادئات الزائدة.

وأخيراً، يتم تحليل تعبير الـ micro RNA أحادي الضخ باستخدام منصة مائعية مجهرية. وتكون النتيجة مستويات تعبير دقيقة وقابلة للتكرار بدرجة عالية للـ micro RNA عبر العينات المستهدفة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن خطوة التنقية الإضافية بعد تضخيم pre-EMP تعزز دقة وقابلية تكرار طريقة multiplex Q-R-T-P-C-R.

ابدأ باستخدام RNA مستخلص من المصل. وباستخدام مجموعة تنقية RNA أو طريقة استخلاص RNA تعتمد على الفينول والكلوروفورم من أنسجة متجانسة مثل triol، يجب أن تتبع جميع عمليات الاستخلاص خطوة غسيل، ويتم تنفيذ جميع عمليات التخزين عند درجة حرارة -80 °C. قم بتركيز محلول RNA.

إذا كنت تبدأ بكمية محدودة من العينة، كما هو الحال عند البدء بالمصل أولاً، فقم بإدخال خزان عينة MicroCon في أنبوب، ثم انقل محلول RNA بواسطة الماصة إلى الخزان، مع الحرص الشديد على عدم لمس الغشاء بطرف الماصة. الآن، ضع الأنبوب والمرشح في جهاز الطرد المركزي بحيث يكون الشريط المشقوق مواجهاً للدوار، وقم بتشغيل عملية الطرد المركزي لمدة ثلاث ساعات تقريبًا. بعد ثلاث ساعات، سيكون RNA قد تركز بالكامل على الغشاء تمهيداً لاستخلاصه.

أضف الكمية المطلوبة من الماء الخالي من RNAs إلى الغشاء، ثم اقلب الخزان وانقله إلى أنبوب جديد. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبقوة قصوى تبلغ 3000 ×g. خزّن الـ RNA المركز عند درجة حرارة -80 °C حتى وقت الحاجة إليه. بعد إجراء تفاعل RT على الـ RNA باستخدام بادئات xpl reverse stem loop، متبوعاً بـ 12 إلى 18 دورة من تفاعل PCR، تُمثَّل الـ microRNAs بواسطة خيوط CD NA.

يُسمى هذا ناتج ما قبل تفاعل PCR، وذلك تمهيداً لتفاعل qPCR اللاحق. يجب تنقية ناتج ما قبل تفاعل PCR باستخدام هلام بولي أكريلاميد بتركيز 10%، جنباً إلى جنب مع سُلّم DNA مكون من 10 أزواج قاعدية، مع تحميل كل مسار بـ 5.5 µL من صبغة Orange G بتركيز 6x مدمجة مع 27.5 µL من ناتج ما قبل تفاعل PCR.

شغّل الهلام عند 150 فولت لمدة تتراوح من 55 إلى 60 دقيقة. يتحرك صبغ phenol blue في هذا الهلام في منطقة 20 زوج قاعدي. بعد انتهاء تشغيل الهلام، صبغه بـ cyber gold لمدة 25 دقيقة، بعيداً عن الضوء وعلى جهاز هزاز من الهلام المصبوغ.

قص نطاق ناتج ما قبل تفاعل PCR الذي يتراوح بين 60 و 80 زوجاً قاعدياً وانقل كتلة الهلام إلى أنابيب مُصنفة. إذا كان تركيز الناتج منخفضاً، فقد لا يكون مرئياً، ولكنه سيظل موجوداً في الهلام. الآن، قم بتفتيت نطاق الهلام باستخدام عملية الطرد المركزي لأنبوب داخل أنبوب وأضف 300 microliters من محلول TEN buffer.

يتم تحضين خليط هلام المنظم لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية مع الرج. وبعد مرور أربع ساعات، يُنقل السائل إلى أنبوب جديد ويُضاف 300 µL أخرى من منظم TEN. ثم يُحضن هذا الخليط طوال الليل عند 4 درجة مئوية مع الرج.

في اليوم التالي، انقل محتويات الأنبوب مرة أخرى ثم ابدأ بعملية ترسيب الإيثانول لمنتج ما قبل تفاعل PCR. عند فتح الشريحة من عبوتها، يجب تحضيرها خلال 24 ساعة، ثم تحميلها خلال 60 دقيقة من عملية التحضير. ابدأ تحضير المصفوفة عن طريق حقن 150 microliters من سائل خط التحكم في كل من المجمعات الموجودة على الشريحة.

احرص على عدم سكب أي سائل على الشريحة أو المداخل، وإلا ستصبح الشريحة غير صالحة للاستخدام. بعد ذلك، ضع الشريحة في الدائرة المائعية المتكاملة أو وحدة التحكم IFC وقم بتشغيل نص التحضير (priming script) الخاص بوحدة التحكم. وبمجرد بدء البرنامج، ابدأ في تحضير العينات.

ابدأ بتحضير خليط العينات المرجعية؛ اخلط مزيجاً من tack man، وuniversal master mix، وكواشف التحميل. ثم باستخدام تنسيق تحميل 96 بئراً، ادمج 2.25 µL من كل عينة مع 2.75 µL من خليط العينات المرجعية لجمع السائل المحمل. قم برج الأنابيب باستخدام جهاز vortex لفترة وجيزة ثم قم بطرد مركزي سريع للصفيحة عند درجة حرارة 4 °C.

لقد تم الآن تحضير طبق العينات. استخدم الآن طبقاً جديداً يحتوي على 96 بئراً لتحضير تركيزات تبلغ 13 ضعفاً من خليط المقايسة. يتم ذلك عن طريق خلط بادئ عام واحد، وبادئ أمامي، ومسبار tac man خاص بالجين في كل بئر.

تكون تركيزات 1X هي 1 µM لكل من البادئ العام والبادئ الأمامي، و0.2 µM لمسبار tac man. ثم يُضاف ما يكفي من tween للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.25%tween في حجم نهائي للبئر يبلغ 5 µL. اخلط جيداً مع تجنب تكون الفقاعات، ثم قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة لتجميع السائل.

هذا هو لوح المقايسة. ابدأ عملية 96.96 Q-R-T-P-C-R بتحميل الشريحة. قم بتحميل العينات أولاً ثم المقايسات بحجم نهائي قدره 5 µL لكل مدخل في IFC.

ثانيًا، قم بتشغيل نص تحميل المزيج (load mix script) لتحميل العينات والمقاييس في الشريحة. عند انتهاء النص، انزع الغشاء الواقي من الشريحة المحملة وأزل أي جزيئات غبار أو شوائب من سطح الشريحة باستخدام شريط لاصق. الآن، قم بإعداد برنامج تضخيم النظام الحيوي.

قم بتحميل الشريحة في النظام وتشغيل البرنامج. يمكن تحليل النتائج باستخدام برنامج fluid dime لتوفير منحنيات التضخيم، وخرائط حرارية للشريحة بأكملها، وقيم CT لكل منها. باستخدام نواتج ما قبل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، والتي تم تنقيتها عن طريق الفصل حسب الحجم على هلامات بولي أكريلاميد أصلية، والنوع البري DG CR eight والطفرة ER null.

تم تحضير الـ RNA مقارنةً بالبروتوكولات السابقة. وقد أدت خطوة التنقية إلى الحصول على المزيد من الـ microRNAs وتقليل الإشارات الإيجابية الكاذبة في كل من خلفيات DGCR eight null و ER null. بالإضافة إلى ذلك، يتيح نهج QR TPCR R المعدل التصنيف الصحيح للـ small RNAs النادرة التي تعتمد على dicer وتكون مستقلة عن D gcr eight.

هنا، تم فحص 48 عينة من السائل الزجاجي (cera) من المرضى ومجموعات الضبط لرصد التغير في تعبير 384 من جزيئات microRNAs المختلفة. وقد تم تطبيع البيانات لكل عينة عن طريق طرح الوسيط المقابل ودون استخدام مادة spike في مجموعات الضبط. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنية multiplex Q-R-T-P-C-R على منصة flu line لتنميط المئات من micronase في وقت واحد عبر العديد من العينات، حتى عند البدء بكميات محدودة جداً من RNA.