من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالإعداد الآلي السريع والموثوق للمصفوفات القائمة على تقنية QPCR. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير مجموعات البادئات للمصفوفة وإعداد الخلطات الرئيسية للعينات المراد فحصها. بعد ذلك، يتم استخدام إما إعداد PCR روبوتي آلي أو نظام ماصات إلكتروني مصفوفي لتوزيع الخلطة الرئيسية للعينة ومجموعات البادئات بدقة في كل بئر من آبار طبق يحتوي على 384 بئرًا.

بعد التحضير، يتم تشغيل تفاعلات PCR في ألواح ذات 384 بئراً باستخدام برنامج PCR الخاص بجهاز light cycler four 80 cyber. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحليل بيانات QPCR وتحديد مستويات التعبير النسبي لكل زوج من البادئات المختبرة، حيث يستهدف كل منها mRNA محدد. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح التغيرات في تعبير مجموعات كبيرة من mRNAs.

وبناءً على ذلك، يمكن للمصفوفات التي تم تطويرها خصيصاً استهداف ملفات pre micro RNA الكاملة، أو مسارات محددة، أو جزيئات أساسية في الإصابة الفيروسية من خلال التوصيف القائم على QPCR. مرحباً، أنا Dirk DMA من قسم الميكروبيولوجيا والمناعة في جامعة كارولاينا الشمالية في تشابل هيل. سنوضح لكم اليوم كيفية إعداد real-time QQPC rra وسنعرض لكم طريقتين.

واحدة باستخدام ماصة يدوية وأخرى باستخدام روبوت. نحن نستخدم هذه التقنية لقياس microRNAs الأولية وmicroRNAs الناضجة في الأورام البشرية. سيقوم بتقديم العرض التوضيحي اليوم كل من بولين تشو وكريستين بو.

فلنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، استخرج ألواح البادئات التي تحتوي على 186 زوجاً من البادئات بتنسيق 96 بئراً وبتركيز 0.5 picaMoles والمخزنة عند درجة حرارة -20 °C.

بعد إذابة الصفائح في درجة حرارة الغرفة، قم برجها باستخدام جهاز الـ vortex وطردها مركزياً لفترة وجيزة. قم أيضاً بإذابة مزيج PCR cyber green two في درجة حرارة الغرفة؛ وسيلزم توفير أربعة أنابيب من المزيج الرئيسي (master mix) لإعداد كل صفيحة بادئات تحتوي على 96 بئراً. قم بتحضير المزيج الرئيسي عن طريق دمج 4 µL من مزيج cyber green و3 µL من الماء المخصص لـ PCR ومن 10 إلى 20 ng من DNA العينة أو cDNA لكل تفاعل في كل أنبوب من أنابيب einor سعة 2 mL الأربعة.

يجب أن يحتوي كل أنبوب على كمية كافية من المزيج الرئيسي (master mix) لما يقرب من 100 تفاعل، مع ترك كمية إضافية لتعويض الفاقد أثناء عملية السحب بالماصة. استخدم جهاز الرج الدوامي (Vortex) لخلط الأنابيب. ابدأ في إعداد مقايسة الرنا الميكروي السلف (precursor micro RNA assay) باستخدام روبوت freedom Tecan EVO، مع تهيئة الروبوت وتحميل برنامج EVO wear.

بعد ذلك، قم بغسل الروبوت ثلاث مرات باستخدام 30 milliliters من سائل النظام لإزالة فقاعات الهواء التي قد تؤثر على دقة عملية السحب الماص. بعد ذلك، قم بتجهيز منصة الروبوت لتشمل طبقاً بـ 384 بئراً وطبق بادئات بـ 96 بئراً. تشتمل الخلطات الرئيسية على حوض يحتوي على 2%bleach، وحاوية سائل النظام الممتلئة، وحاوية نفايات فارغة.

ابدأ تشغيل الروبوت الآلي عن طريق تحديد run مرتين في نهاية البرنامج. قم بإزالة لوحة الـ 384 well plate وإغلاقها باستخدام light cycler four 80 ceiling foil. بعد ذلك، قم بطرد اللوحة مركزياً.

ضع لوحة الـ 384 بئراً المغلقة بإيجاز في الموضع الأول من الحاضنة (hotel). ثم كرر هذه العملية للوحة البادئات الثانية باستخدام خلطات رئيسية (master mixes) جديدة ولوحة 384 بئراً جديدة. ضع لوحة الـ 384 بئراً المغلقة الناتجة في الموضع الثاني من الحاضنة (hotel).

افتح برنامج EVO wear جديد لتحميل جهاز التدوير الضوئي من الفندق وقم بضبط معلمات التدوير. ثم اختر تشغيل مرتين. سيقوم نظام Freedom Evo تلقائيًا بتحميل كل لوحة في جهاز التدوير الضوئي وتشغيل برنامج تدوير HRM الخاص بـ cyber green.

بمجرد الانتهاء، قم بمراجعة النتائج وتحليلها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب كبديل لاستخدام الروبوت. يمكن استخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات ذات مصفوفة للبدء في وضع محتويات أنبوب المزيج الرئيسي الأول في خزان.

اضبط الماصة الإلكترونية لسحب 16 µL من المزيج الرئيسي (master mix) مع خطوتين للتوزيع بمقدار 8 µL لكل منهما، تليها خطوة تطهير. بعد ضبط الماصة، اسحب 16 µL من المزيج الرئيسي وابدأ في توزيعه في لوحة 384 wheel plate. وزع أول 8 µL في صفوف متبادلة في العمود الأول باستخدام الصفوف من A إلى O، مع ترك العمود التالي فارغاً.

قم بتوزيع ثمانية ميكرولترات ثانية في نفس الصفوف من العمود الثالث. ثم قم بتفريغ الماصة فوق حاوية النفايات وتخلص من الرؤوس باتباع هذا النمط من ترك صفوف وأعمدة متبادلة. كرر عملية التوزيع عبر اللوحة لخمس دورات إضافية لسحب المزيج الرئيسي الثاني.

استخدم نفس الصفوف المستخدمة في المزيج الرئيسي الأول، ولكن ابدأ من العمود الثاني. كرر هذا الإجراء للمزيجين الرئيسيين الثالث والرابع، بدءاً من العمودين الأول والثاني على التوالي، ولكن باستخدام الصفوف من B إلى P من لوحة البادئات هذه المرة. اضبط الماصة الإلكترونية لسحب 2 µL وتفريغ 2 µL مع اتباعها بخطوة تطهير.

انقل 2 µL من البادئات من العمود الأول، الصفوف من A إلى H، في لوحة بادئات ذات 96 بئراً إلى كل عمود فردي (بفاصل عمود) في العمود الأول من لوحة ذات 384 بئراً، مع التفريغ فوق حاوية النفايات والتخلص من الرؤوس. كرر هذا النمط لبادئ quatt لخلطات الماستر الثلاث المتبقية في العمودين الأول والثاني. ثم تابع هذه العملية للأعمدة من 2 إلى 12 في لوحة البادئات ذات 96 بئراً، مع الانتقال بمقدار عمودين في اللوحة ذات 384 بئراً لكل عمود بادئ.

بعد ذلك، قم بإغلاق الأطباق بغطاء جهاز التدوير الضوئي ورقائق الألومنيوم ثم قم بطردها مركزياً. بعد الانتهاء من عملية الطرد المركزي مباشرة، ضع الأطباق في جهاز التدوير الضوئي Four 80 وقم بتدوير الأطباق باستخدام صيغة كشف Cyber Green I HRM.

باستخدام نفس ظروف الدورة السابقة، كرر هذا الإجراء باستخدام لوحة البادئات الثانية Eloqua في لوحة جديدة ذات 384 بئراً باستخدام مخاليط رئيسية مُحضّرة حديثاً. تظهر بصمات micro RNA السليفة من خلال التنميط باستخدام مصفوفة مبتكرة تعتمد على QPCR. تم حساب متوسط delta CT بعد تطبيعه بالنسبة لـ U six، وتم تحميل القيم المعيارية في المصفوفة.

برنامج MINOR الذي نتج عنه ثلاث مجموعات متميزة معروضة كخرائط حرارية. يظهر التعبير النسبي لكل RNA مجهري طلائعي، حيث يمثل اللونان الأحمر والأزرق الزيادة والنقصان في التعبير النسبي على التوالي. وتُشير كثافة اللون إلى درجة التغير في التعبير.

خضعت غالبية جزيئات الـ microRNAs السلائف لتغيرات طفيفة وغير مؤثرة كما كان متوقعاً. ومع ذلك، فقد شهد جزء صغير من جزيئات الـ microRNAs السلائف زيادة معنوية طوال فترة التجربة الزمنية. بالإضافة إلى ذلك، انخفض المستوى النسبي لبعض جزيئات الـ microRNAs السلائف بشكل كبير.

في بعض الحالات، تتجمع هذه الجزيئات معاً أيضاً في تحليل الخريطة الحرارية. واعتماداً على التجربة، قد تظهر مجموعات تعتمد على العدوى الفيروسية، أو تعبير محدد بنوع الخلية لـ precursor microRNAs، أو precursor microRNAs يتم تنظيمها بواسطة جزيء مشترك أو مسار إشارات معين.

تظهر متوسطات عتبات الدورات أو الـ cts لعينة سالبة لفيروس ساركوما كابوزي المرتبط بالهربس عند تشغيلها بأربع مكررات. ومن المهم ملاحظة أن المستضد النووي المرتبط بالكمون لفيروس ساركوما كابوزي المرتبط بالهربس أو KSHV Lana لم يتم اكتشافه في هذه العينة بواسطة مصفوفة QPCR عالية الحساسية. ومع ذلك، فقد تم التعبير عن كل من الضابط الداخلي U six و let seven a، وهو micro RNA بشري سابق عالي التعبير، بمستويات قابلة للكشف.

أخيرًا، وكما كان متوقعًا، لم يؤدِ الضابط السلبي المكون من ماء بدرجة نقاء PCR إلى إنتاج A-Q-P-C-R. يظهر هنا تحليل منحنى الانصهار لبادئين مختلفين باستخدام نفس العينة المكررة.

من الواضح أن درجة حرارة الانصهار تختلف بين زوجي البادئات، إلا أن العينة تنصهر عند درجة الحرارة ذاتها تمامًا في كل مكررة. قد تشمل علامات العينة التالفة أو التي يُحتمل أن تكون ملوثة ظهور عدة قمم انصهار، مما يشير إلى وجود مصدرين مختلفين للمدخلات. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية إعداد تجارب QPCR في الوقت الحقيقي باستخدام روبوت.

من المهم أن تدرج جميع الضوابط وأكبر عدد ممكن من الجينات المرجعية. لذا، نشكركم على المشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.