تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أجنة خيمرية (chimeric embryos) عن طريق نقل الأديم الظاهر من أجنة مانحة إلى الفك العلوي النامي لأجنة الدجاج. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الأديم المانح للنقل، ثم يتم تحضير موقع المضيف للتطعيم.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في وضع النسيج المانح على موقع المضيف وتثبيت الطعم في موضعه. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر انغراسًا حصريًا للأديم الظاهر المانح، ومن خلال التحليل الجزيئي والمورفولوجي، يمكن تحديد وظيفة الأديم الظاهر المانح المعاد ترميزه. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأحياء النمائي، مثل تحديد دور الأنسجة المختلفة أثناء التخلق الشكلي.

سوف تقوم الدكتورة Diane، وهي باحثة أولى من مختبرنا، بشرح الإجراء. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير الأوساط الزراعية وتأكد من توفر جميع المحاليل المطلوبة وأنها في درجة الحرارة الصحيحة. بعد ذلك، وأثناء ارتداء واقي العين المناسب، قم بسحب الأنابيب الشعرية الدقيقة لتصل إلى نقطة دقيقة فوق لهب كحولي.

لصنع دبابيس زجاجية تهدف إلى شحذ إبر التنجستن، يتم تثبيت الإبر في لهب مشعل البروبان. ابدأ عملية استخراج الجنين المانح من القشرة بوضع قطعة من الشريط اللاصق على طرف البيضة. استخدم بعد ذلك سن إبرة تشريح لإحداث ثقب صغير في مركز الشريط اللاصق.

أدخل محقنة سعة 10 milliliter وإبرة تحت الجلد قياس 18 gauge في الثقب، واسحب 1 milliliter من الألبومين من البيضة. ثم باستخدام إبرة تشريح، اصنع ثقباً صغيراً في الجزء العلوي من القشرة. ضع قطعة ثانية من الشريط اللاصق لتغطية هذا الثقب.

اصنع فتحة دائرية في البيضة باستخدام زوجين من الملاقط. أمسك بالجنين وضعه في طبق يحتوي على PBS بارد جداً لغسله. بعد إزالة رأس الجنين، ضعه في طبق زراعة أنسجة يحتوي على DMEM خالي من المصل في درجة حرارة الغرفة.

ضع الطبق تحت مجهر التشريح مع تثبيت الرأس باستخدام الملقط. استخدم مقصاً نابضاً لإجراء تشريح عياني للفك العلوي واللجون وفصلهما عن بقية الرأس. ثم باستخدام حامل شفرات مزود بشفرة حلاقة حادة، قم بتشذيب النتوء الأنفي الجبهي من الفك العلوي.

استخدم ماصة لنقل النتوء الأنفي الجبهي إلى طبق بتري بقطر 30 مليمتر يحتوي على حجم كافٍ من diss في PBS، ثم قم بالتحضين على الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد انقضاء وقت التحضين، قم بشفط محلول dispa دون تحريك النسيج. بعد ذلك، قم بتغطية الأنسجة تماماً بوسط DMEM المحتوي على 1%BSA.

لإيقاف عملية الهضم، انقل النسيج إلى طبق زراعة جديد. ثم، أثناء العمل تحت مجهر تشريحي، ثبت النسيج باستخدام إبرة تنجستن غير مدببة وباستخدام إبرة تنجستن مدببة.

افصل الأديم الظاهر عن طريق تقشيره بعيداً عن الأنسجة الأخرى. وبمجرد تحضيره، احفظ النسيج المطعّم في وسط DMEM مع BSA على الثلج حتى يصبح المضيف جاهزاً لعملية الزرع. وباستخدام الطريقة الموضحة سابقاً، قم بإنشاء نافذة في بيضة الدجاج.

ضع البيضة التي تحتوي على الجنين تحت مجهر التشريح باستخدام زوجين من الملاقط. أمسك بغشاء IGN والسلى وقم بتمزيقهما برفق لإحداث فتحة وكشف جنين المضيف. قم بتدوير الرأس بوضع ملقط على العين اليمنى والضغط عليها مع تثبيت الرأس.

استخدم ملقطاً وإبرة لإزالة أدمة المضيف لتهيئة مكان الطعم. أضف 2 µL من الأحمر المتعادل إلى طبق بتري الذي يحتوي على الطعوم المُحضرة. استخدم ماصة زجاجية لنقل الطعم إلى المضيف.

ضع الطعم في الموضع المخصص ليحل محل الأديم الظاهر الذي تمت إزالته. أدخل دبوسًا زجاجيًا في كل زاوية من زوايا النسيج المطعّم لتثبيت الطعم في مكانه بعد عملية الزرع. أغلق النافذة بإحكام باستخدام شريط لاصق.

أعِد الجنين إلى الحاضنة حتى يصل إلى مرحلة النمو المطلوبة للتحليل، تظهر هذه الصورة نسيجاً من الـ URA لصيص سمان تم صبغه بجسم مضاد نوعي للسمان anti Q-C-P-N-A. يقع النسيج المطعّم بين السهمين. لا يوجد دليل على صبغ QCPN في نسيج الـ meen kind من كيميرا فأر وصيص تظهر هنا، ومرة أخرى، يقع النسيج المطعّم بين السهمين في C، والتهجين في 2 باستخدام مسبار نوعي للتسلسل المتكرر sign B two.

يكشف محاكاة جينات الفئة الأولى أن تعبير sign B two يقتصر على الوم الذي يتكون من الطعم الموضح هنا كصورة لـ chime mirror لجنين سمان، والذي خضع لصبغ ثلاثي (trichrome stained)؛ حيث تظهر الصبغة الثلاثية الكولاجين والعظام باللون الأزرق. ويظهر تضاعف هيكل الفك العلوي كما يشير السهم. وتوضح هذه الصورة chime mirror لجنين فأر خضع بدوره للصبغ الثلاثي مرة أخرى.

يظهر تضاعف في هيكل الفك العلوي. تُظهر هذه الصورة تهجيناً موضعياً مشعاً في C لتعبيير BMP seven الطبيعي في الميزنشيم لجنين دجاج مُطعم، والنسيج المعروض هنا هو من كيميرا بين فأر ودجاج. ويمكن ملاحظة أن تعبير BMP seven قد تم تحفيزه في الميزنشيم المجاور للطعم كما يشير السهم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع أجنة الدجاج لتقييم الآليات التي تنظم تطور النتوء الجبهي والأنفي.