مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

الهدف من هذا الإجراء هو مراقبة سلوك مستنبت الخلايا الجذعية للجنين في الرأس. تحت ظروف استنبات محددة. وتتمثل الخطوة الأولى في جمع القرون الرحمية من فأرة حامل في وقت محدد.

بعد 8.5 أيام من التزاوج. بمجرد عزلها، تُزال الأجنة من الساقط (decidua) ويُزال كيس المح (yolk sac) لإجراء التنميط الجيني. بعد ذلك، يتم تشريح المناطق القحفية مجهرياً ونقلها إلى أطباق زراعة أنسجة مغطاة بالمصفوفة خارج الخلية (extracellular matrix).

تُترك المستأصلات X لتلتصق ويتم استزراعها لمدة تصل إلى 48 ساعة في وجود أو غياب عوامل دوائية محددة. وفي النهاية، يتم التقاط صور للمستأصلات لإظهار الاختلافات في هجرة الخلايا. وتعتبر هذه الطريقة مفيدة للإجابة على أسئلة رئيسية مثل ما هي مسارات التأشير وبروتينات المصفوفة خارج الخلوية المشاركة في التحكم في سلوك الحافة العصبية أثناء ارتفاع الطيات العصبية.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات التشريح الدقيق يصعب تعلمها وتتطلب الصبر والممارسة لإتقانها. للبدء، إذا كان سيتم إجراء صبغ كيميائي نسيجي مناعي، فقم بتجهيز شرائح التغطية؛ وخلاف ذلك، تخطَّ هذه الخطوة وقم بطلاء أطباق زراعة الأنسجة مباشرة بـ ECM. يتم تعقيم شرائح التغطية الزجاجية الدائرية بقطر 12 millimeter عن طريق غمسها في الإيثانول، ثم تُترك لتجف في الهواء. بعد ذلك، ضع شريحة تغطية معقمة في كل بئر من أطباق ذات 12 بئراً.

اعمل داخل غطاء تدفق هوائي صفحي (laminar hood) بوضع 1 mL من المادة الخلالية أو ECM لطلاء شرائح التغطية أو قاع طبق زراعة الأنسجة. حضن الطبق عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات، وبعد فترة التحضين، قم بشفط محلول ECM والغسل ثلاث مرات باستخدام PBS. في هذه المرحلة، يمكن استخدام الأطباق المطلية فوراً أو تغليفها وتخزينها عند 4 °C لمدة تصل إلى أسبوعين.

تساعد هذه الطريقة في تصور الجنين الشفاف. يتم تحضير ألواح Syl guard ذات خلفيات سوداء مقاومة، وذلك باتباع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

قم بتحضير أدوات التشريح عن طريق إدخال دبوس دقيق في حامل الدبابيس. استخدم حجر شحذ لشحذ الملاقط عندما يتم تحضير كل شيء. قم بجمع الرحم من فأرة حامل في مرحلة زمنية محددة، بعد 8.5 days من التزاوج.

ضع الرحم المعزول في طبق يحتوي على PBS معقم وقم بغسله. بمجرد وضعه تحت مجهر التشريح، افصل كل جزء من السفاق (decidua) على حدة باستخدام المقص والملاقط. قم بإزالة النسيج الضام الرحمي بحركة تمزيق، مع الحرص على عدم تسليط ضغط يؤدي إلى خروج الجنين من السفاق.

استخدم الملقط لتمزيق أنسجة الرحم بعناية من الجانب المقابل للمشيمة. ولإظهار الجنين الموجود داخل كيس المح، استخدم الملقط لقرص الجنين وكيس المح وفصلهما عن المشيمة، ثم أزل أنسجة الرحم من الطبق. بعد ذلك، استخدم الملقط لتمزيق كيس المح بلطف وإزالته من الجنين.

ضع كيس المح، باستخدام ماصة، في أنبوب إيبندورف لإجراء التنميط الجيني، وبمجرد عزله، قم بتحديد مرحلة الجنين عن طريق عد القطع العضلية (somites). ومن الناحية المثالية، سيكون الجنين بين المرحلة السادسة والعاشرة، أي في مراحل متعددة. في هذه المرحلة، تبدأ الطيات العصبية للتو في الارتفاع، ولم تحدث بعد عملية التشكيل الرئيسية للمتوسطة القحفية.

بمجرد تحديد المرحلة، انقل الجنين إلى لوحة حماية خلايا سوداء تحتوي على DMEM بدون فينول الأحمر. أولاً، وتحت مجهر تشريحي بأعلى تكبير ممكن، ركز على رأس الجنين مع إمساك إبرة تشريح في كل يد، وقم بتشريح الرأس أمام حدود الـ rmba. بعد ذلك، اقطع على طول الخط الناصف لـ bi.

قم بتشريح الرأس إلى نصفين متساويين باستخدام إبرة تشريح في كل يد. قم بتشريح الحواف الخارجية على طول هامش رأس الجنين والخط الناصف. أزل الأنسجة الزائدة حسب الحاجة لمنع الخلط بين التوضيحات المطلوبة والأنسجة غير المرغوب فيها.

ستحتوي القطعة المستأصلة على العرف العصبي القحفي المهاجر، والاديم المتوسط الجانبي، والاديم الظاهر السطحي لإزالة الخلايا المرتبطة بشكل فضفاض. قم بالماصة بالسحب والدفع بعناية باستخدام طرف ماصة سعة 200 microliter. وبالنسبة لعملية النقل، قم بالتقاط القطعة المستأصلة بعناية باستخدام طرف الماصة.

في حوالي 10 µL من DMEM، ضع في مركز بئر زراعة أنسجة مغطى 20 µL من DMEM الدافئ المدعم بـ 15% FBS، ويمكن الآن نقل طبق الزراعة إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد حوالي ساعة إلى ساعتين، تلتصق القطعة النسيجية (explant) ويمكن إضافة 250 µL إضافية من الوسط الغذائي. بعد حوالي 24 ساعة، ستكون القطعة النسيجية ملتصقة بإحكام بغطاء الشريحة.

في هذا الوقت، يمكن إضافة العوامل الدوائية إلى الأوساط بعد مرور 24 ساعة إضافية، وستهاجر الخلايا من هذه. وعادةً ما يتم الحصول على الصور لتوثيق مسافة وعدد الخلايا التي تهاجر من هذه. وفي هذه المرحلة، تبدأ sinces في إظهار علامات انخفاض الحيوية مع ملاحظة ذلك في فترات الحضانة الأطول.

إليك أمثلة للخلايا المهاجرة من أنسجة القمة الرأسية والجنينية. بعد مرور 48 ساعة في ركائز مختلفة، يعتمد كل من شكل وحجم الخلايا المهاجرة من القطعة النسيجية على نوع الركيزة. وقد تم دعم الهجرة الخلوية على الفبرونيكتين، واللامينين، والـ Matrigel، والمادة الخلالية (ECM)، وحمض الهيالورونيك.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل التألق المناعي والتصوير الحي لمزيد من الاستقصاء في المسارات التي تنظم سلوك الـ cranial mesenchyma أثناء ارتفاع الطيات العصبية.