ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

الهدف من هذا الإجراء هو جمع صور متسلسلة عبر منطقة محددة من أنسجة الدماغ باستخدام حزمة الأيونات المركزة والمجهر الإلكتروني الماسح. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تقسيم الدماغ إلى شرائح يتم صبغها ثم دمجها في الراتنج. والخطوة الثانية هي قطع المنطقة المطلوبة من مقطع الدماغ المدمج وتثبيتها على كتلة راتنج فارغة.

تتمثل الخطوة الثالثة في تهذيب كتلة الراتنج باستخدام المقطاع فائق الدقة (ultra microtome)، واستخدام الحزمة الأيونية للمجهر لعزل المنطقة المراد تصويرها فقط. أما الخطوة النهائية فهي التصوير المتسلسل لوجه من وجوه كتلة الراتنج باستخدام الحزمة الأيونية لإزالة طبقات رقيقة بشكل متكرر قبل التقاط كل صورة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر صوراً متسلسلة عبر منطقة الاهتمام.

يتم جمع سلسلة الصور تلقائيًا، وعادة ما تحتوي مجموعة البيانات على فوكسيلات متناحية (isotropic voxels) بحيث يمكن عرض هياكل الصور من أي زاوية في المجموعة. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر الإلكتروني النافذ للمقاطع المتسلسلة، في قدرتها على تحقيق دقة أعلى بكثير في المحور Z. ومقارنة بالتصوير المقطعي الإلكتروني، فهي قادرة على تصوير أحجام أكبر بكثير بدقة مثالية للعينات المدمجة في الراتنج.

تبدأ الإجراءات بتشريح الدماغ المثبّت من جرذ تم تخديره وإجراء تروية له. يتم غمر الدماغ في 5% aeros دافئ داخل قالب بلاستيكي، مع توجيه الدماغ إلى الزاوية الصحيحة قبل أن يتصلب الـ aros؛ ثم يتم تثبيت كتلة الـ aeros التي تحتوي على الدماغ في حامل العينات باستخدام جهاز vibrato slice. تُقطع مقاطع إكليلية بسماكة 80 micron، ويتم قطع عدد المقاطع اللازمة لتشمل المنطقة المستهدفة.

بعد ذلك، ضع العينات في قوارير عزل زجاجية سعة 20 milliliter. ضع ما يصل إلى 10 مقاطع في كل قارورة. اشطف العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام buffer K coate بتركيز 0.1 molar.

ثم صبُغ العينات باستخدام 1.5% potassium cyanide و 1% osmium tetroxide في 0.1 molar K coate buffer لمدة 30 دقيقة. استمر في صبغ العينات باستخدام 1% osmium Tetroxide في 0.1 molar K coate buffer لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، اشطف العينات مرة واحدة بالماء المقطر المزدوج لمدة ثلاث دقائق، ثم صبغها باستخدام 1% al acetate في الماء المقطر المزدوج لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، اشطف المقاطع لمدة خمس دقائق في ماء مقطر مرتين، ثم قم بتجفيفها باستخدام سلسلة كحولية متدرجة، مع ترك دقيقتين لكل عملية تغيير. الخطوة التالية هي غمر المقاطع في تركيزات متزايدة من راتنج Duran الممزوج بالكحول، مع ترك 30 دقيقة بين كل تغيير. ابدأ بنسبة 50 إلى 50 من الإيثانول إلى الراتنج، ثم 30 إلى 70، ثم 10 إلى 90، وأخيراً ضع المقاطع في راتنج بتركيز 100% لمدة 30 دقيقة.

ثم استبدل الوسط براتنج duran طازج بنسبة 100%. قم بالرج ببطء لمدة ساعة واحدة على جهاز الخلط الدوار. بعد عملية الطمر، استخدم عود كوكتيل خشبي لوضع المقاطع على شرائح مجهرية زجاجية تم طلاؤها مسبقاً بعوامل فصل القوالب.

ضع أكبر عدد ممكن من المقاطع على الشرائح، مع الحرص على عدم تكدّسها. تأكد من وضع ملصق تعريف بين الشرائح المجهرية. ضع الشرائح في فرن بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، أخرج العينات من الفرن. ادفع شفرة حلاقة برفق بين شرائح المجهر الزجاجية، ثم أخرج طبقة الراتنج التي تحتوي على العينات من بين الشرائح ممسكاً بطبقة الراتنج بأصابعك. اغسل العينة برفق تحت مياه جارية.

لإزالة أي عوامل فصل للقوالب، ضع العينة تحت مجهر تشريحي مزود بإضاءة نافذة باستخدام عدسة شيئية ذات قوة تكبير منخفضة. حدد المنطقة المراد دراستها باستخدام إبرة دقيقة. استخدم شفرة حلاقة لقص مربع صغير بقياس 3 mm في 3 mm حول المنطقة المحددة.

استخدم الغراء الأكريليكي لتثبيت كتلة الراتنج الصغيرة فوق كتلة راتنج فارغة. بعد ذلك، قم بتثبيت الكتلة في حامل الميكروتوم الفائق (ultra microtome). وبالنظر عبر المجهر المجسم الملحق، استخدم شفرة حلاقة لتقليم المنطقة المحيطة بمنطقة الاهتمام حتى لا يتبقى سوى هرم صغير من المادة.

اقطع حافة القالب بالقرب من المنطقة المستهدفة بزاوية مائلة بالنسبة للسطح العلوي للقالب باستخدام سكين زجاجية مثبتة في جهاز الميكروتوم الفائق (ultra microtome). قم بتقليم القالب بشكل إضافي بحيث يمكن تحديد موقع المنطقة المستهدفة بدقة بالنسبة لأبعاد سطح القالب. أخرج القالب من جهاز الميكروتوم الفائق وضعه تحت مجهر الضوء النافذ.

قم بتصوير المنطقة المراد دراستها. استخدم منشار المجوهرات لقص الكتلة المشذبة بعيداً عن بقية قاعدة الراتنج باستخدام طلاء الكربون. قم بتثبيت الكتلة المنفصلة على حامل عينات SEM ووجهها بحيث يكون الجانب المراد تصويره مواجهاً للحافة الخارجية.

بعد جفاف الغراء، انقل التحضير إلى نظام التبخير الفراغي والطلاء، وقم بتغطية القالب بطبقة رقيقة من الذهب تزيد عن 20 nanometers. أصبح قالب النسيج المدمج في الراتنج الآن جاهزاً للتصوير باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ذو الحزمة الأيونية المركزة. أدخل العينة في حاملها داخل المجهر بتكبير منخفض، وباستخدام تصوير الإلكترونات الثانوية، قم بتوجيه القالب بحيث تكون المنطقة المستهدفة والجانب المراد تصويره من القالب في مواجهة المجهر.

يقوم المشغل بتوجيه الكتلة بحيث يكون الوجه المراد تصويره موازياً لحزمة الطحن. يؤدي ذلك إلى توجيه حزمة الإلكترونات بزاوية 54 درجة بالنسبة لهذا الوجه، باستخدام تيار حزمة أيونية يتراوح بين 13 إلى 27 nano amps، وعند جهد 30 kilovolts.

قم بإزالة شريط ضيق من الراتنج من مقدمة المنطقة المراد تصويرها. بعد ذلك، انتقل إلى وضع تصوير تشتت الإلكترونات المرتدة (back scattered imaging) لعرض الوجه الممسوح الذي يعلو المنطقة المستهدفة. باستخدام الصورة المرجعية المأخوذة مسبقًا عبر المجهر الضوئي وصورة الوجه الممسوح، حدد المنطقة الدقيقة على الكتلة المراد مسحها وتصويرها باستخدام نظام حقن الغاز الخاص بالمجهر.

قم بترسيب طبقة واقية من الكربون أو المعدن بسمك ميكرون واحد تقريباً على سطح الكتلة فوق المنطقة المراد دراستها باستخدام تيار قدره 700 picoamps. أخيراً، قم بطحن منطقة الكتلة التي سيتم التقاط الصور النهائية ضمنها. اترك شعاع الطحن يطحن وجه الصورة هذا بالكامل حتى لا تظهر أي آثار طحن على الوجه.

حدد معلمات المجهر للتصوير المتسلسل للوجه. تكون المعلمات النموذجية هي جهود تتراوح بين 1.2 إلى 2 kilovolts مع أحجام بكسل تتراوح بين 4 إلى 20 nanometers. يجب أن يكون زمن بقاء البكسل حوالي 10 microseconds بحيث يكون الوقت الإجمالي لتسوية الوجه والتقاط صورة واحدة أقل من دقيقتين.

اترك المجهر ليرتاح لمدة ساعتين على الأقل للسماح بأي تغيرات حرارية بالاستقرار. لبدء العملية، ابدأ عملية الطحن والتصوير للحصول على صور متسلسلة عبر المنطقة المستهدفة. يوضح هذا الشكل صورة تشتت خلفي ذات تباين عكسي لوجه الكتلة، تظهر البنية الدقيقة داخل منطقة من الدماغ الملتف.

تظهر جميع الأغشية بوضوح، بالإضافة إلى البنى الجزيئية الكبيرة. تتكون هذه الصورة من إجمالي 1,600 صورة تم جمعها بفاصل قدره خمسة نانومتر، مما نتج عنه مصفوفة صور ذات فوكسلات متساوية الخواص. يمكن تصوير هذه المصفوفة في أي مستوى وبنفس الدقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أنسجة الدماغ للتصوير المتسلسل باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ذو الشعاع المركّز.