الركض الخلايا الجذعية العصبية البشرية

أهلاً بكم، أنا ستيف. أعمل في مختبر الدكتور فلاجناجان في قسم علم الأمراض بجامعة كاليفورنيا، إيرفاين. سأوضح لكم اليوم كيفية تقسيم الخلايا السلفية العصبية البشرية.

تتضمن هذه التقنية طلاء دورق جديد بمحلول من الفيبرونيكتين البشري، ثم رفع الخلايا باستخدام محلول تفكيك الخلايا، ومن ثم تحييد محلول تفكيك الخلايا بمحلول مصل بتركيز 10%، وطرد مركزي لمعلق الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في وسط غذائي جديد، ونقل معلق الخلايا إلى دورق جديد. في مختبرنا، نقوم بزراعة الخلايا العصبية السلفية البشرية عن طريق تغيير نصف أوساطها الغذائية كل يومين، ونقوم بتمريرها مرة واحدة تقريباً في الأسبوع عن طريق تقسيمها بنسبة واحد إلى اثنين. وعندما أقوم بتمرير الخلايا، قد أقوم بعدها إذا كنت أرغب في استخدامها في تجربة كيمياء مناعية، أو إذا كنت أرغب في إجراء عملية ترانسفكشن باستخدام مؤثر نووي.

من المهم استخدام محلول تفكيك الخلايا عند تجميع الخلايا؛ لأنه أولاً غير إنزيمي، على خلاف التريبسين، وهو أكثر رفقاً بالخلايا. مرحباً بكم، نحن الآن في غرفة زراعة الأنسجة، وقبل أن أريكم كيف تبدو قارورة تحتوي على خلايا بشرية سلفية متلاحمة، سأقوم أولاً بتحضير بيئة زراعة الأنسجة. أولاً، سأقوم بإطفاء الأشعة فوق البنفسجية وتشغيل الضوء وتدفق الهواء.

بعد ذلك، سأقوم بتطهير غطاء التدفق الصفائحي باستخدام إيثانول 70% عن طريق رش منشفة ورقية ومسح الغطاء بها. من المهم رش المنشفة الورقية بإيثانول 70% وعدم رش الجزء الداخلي من الغطاء مباشرة، لأن رش الغطاء بإيثانول 70% قد يؤدي إلى تلف مرشح HEPA، وهو مكلف للغاية. بعد ذلك، سأقوم برش جميع الكواشف والأدوات.

وفي النهاية، سأقوم برش خراطيم vacuum، وبذلك نكون قد انتهينا. لنلقِ نظرة على هذه الخلايا. تبدو هذه الخلايا وكأنها وصلت إلى درجة confluence بنسبة 80% تقريباً.

هذه خلايا عصبية سلفية بشرية معزولة من أجنة بشرية، ونقوم بتنميتها في دوارق T 25. نقوم بتجزئتها كل أسبوع تقريباً بنسبة واحد إلى اثنين. أنا مستعد الآن لنقل الخلايا إلى مزارع جديدة.

أولاً، سأحضر دورق T 25 جديداً قمت بتغليفه لمدة أربع ساعات ببروتين الفيبرونيكتين البشري من شركة BD biosciences. لقد قمت بإزالة محلول الفيبرونيكتين، وسأقوم الآن بشطف هذا الدورق باستخدام BBS قبل نقل الخلايا إليه.

والآن سأقوم بإخراج الخلايا من الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة. ها هي ذي. الآن سأقوم بإزالة محلول الغسيل PBS من الفلاسك الجديد الذي تم طلاؤه ببروتين الفيبرونيكتين البشري.

وسأقوم بإضافة 2 mL من الوسط المكيّف القديم إلى الدورق الجديد. والآن، أحتاج إلى شطف الخلايا باستخدام PBS قبل أن أتمكن من إزالتها من السطح. لذا، سأقوم أولاً بإزالة الوسط المتبقي، ثم إضافة حوالي 2 mL من PBS على الفور لتجنب جفاف الخلايا.

سأنتظر حوالي دقيقتين قبل إزالة PBS وإضافة محلول تفكيك الخلايا من أجل إزالة الخلايا عن سطح الفلاسك. الآن سأقوم بإزالة PBS، وسأحاول مجدداً إضافة محلول تفكيك الخلايا على الفور حتى لا تجف الخلايا. لذا سأقوم بإضافة 1.5 mL من محلول تفكيك الخلايا.

على عكس محلول PBS، سأضيفه مباشرة فوق الخلايا، وسأحاول تغطية أكبر مساحة ممكنة من السطح. لذا سأقوم بتحريك الدورق من جانب إلى آخر بينما أضيف هذا المنظم ببطء فوق الخلايا. وسأنتظر الآن حوالي خمس دقائق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال عن السطح.

سأترك الدورق في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء سحب الغازات. وكما ترون هنا، تبدأ الخلايا أولاً في التكور، ثم تبدأ في الانفصال عن السطح، ويمكنكم بالفعل رؤية بعض الخلايا تطفو بالفعل. وإذا نقرتم على جانب الدورق برفق، فإن ذلك سيساعدها على الانفصال.

لقد مرت خمس دقائق، وكما تلاحظون، أصبح المحلول كثيفاً جداً بالخلايا التي انفصلت عن السطح. وسأقوم الآن بتحييد تأثير منظم تفكيك الخلايا عن طريق إضافة 4.5 mils من وسط يحتوي على المصل. لذا سأستخدم 10% من مصل جنين البقر المعطل حرارياً في وسط D-M-E-M-F 12، وسأضيفه مباشرة على سطح القارورة للتأكد من عدم بقاء أي خلايا ملتصقة.

سأقوم بالماصة بسحب السائل ودفعه بلطف لتحرير أي خلايا متبقية. وبعد ذلك، سأنقل محلول الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mil. ثم سأقوم بطرد مركزي للأنبوب بسرعة 1000 RPM لمدة دقيقة واحدة.

لقد انتهت عملية دوران الخلايا، ولدينا هنا راسبة خلوية رائعة. سأقوم بإزالة الوسط المصلِي بحذر شديد للغاية دون محاولة زعزعة الراسبة. ومن ثم سأقوم بإعادة تعليق الراسبة في 4 mL من الوسط.

لذا، سأحاول إعادة تعليق الراسب بحيث لا تتبقى أي تكتلات خلوية، ليصبح المحلول متجانساً وخالياً من التكتلات. وبما أنني أقوم بعملية تقسيم بنسبة 1 إلى 2، سآخذ 2 mL من أصل 4 mL وأنقلها إلى الدورق الجديد الذي يحتوي بالفعل على 2 mL من الوسط المكيف. وأخيراً، سأقوم بتمييز الدورق بكتابة نوع الخلايا، ورقم الممر، والتاريخ.

هذه نظرة على الخلايا التي قمنا بنقلها قبل نصف ساعة. وكما تلاحظون، فإن معظمها قد التصق بالسطح وبدأت في إرسال استطالات خلوية. هذا كل شيء يا رفاق.

والآن أنا مستعد للعد.