يرتبط فخ كروموسوم لتحديد الحمض النووي تفاعلات طويلة المدى

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف وتحديد شركاء DNA المرتبطين بعيد المدى. يتم تحقيق ذلك عن طريق التثبيت، وتحلل الخلايا، وهضم DNA بواسطة إنزيم التقييد الأول، يليه الربط لإنشاء DNA خيمري يتكون من قطع من الجينين المرتبطين. بعد ذلك، تُضاف الروابط إلى DNA الخيمري بعد عملية الهضم الثاني بإنزيم التقييد؛ ولتسهيل تضخيمه، يتم إجراء تضخيم PCR باستخدام بادئات متخصصة للحمض النووي الرابط والطعم من أجل الحصول على كميات كافية من قطع DNA المرتبطة. يتم الحصول على نتائج تظهر شركاء DNA المرتبطين بعيد المدى مع DNA الطعم بناءً على تحليل تسلسل قطع DNA المضخمة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية مثل التقاط التأكيد الكروموسومي أو Three C، في أن A-C-T-S-A يمكن استخدامه لتحديد شريك DNA مرتبط بعيد المدى وغير معروف بفعالية، بينما ظهرت تقنية Three C للتحقق فقط من التفاعلات المشتبه بها مسبقاً. لبدء هذا البروتوكول، يتم استزراع الخلايا البشرية في حضانة مزودة بـ 5% من ثاني أكسيد الكربون عند 37 °C حتى تصل نسبة التلاحم إلى 80 إلى 90%.

تُستخدم خلايا سرطان اللوكيميا الحمضية البشرية (prom acidic leukemia cells) في هذا العرض التوضيحي. يتم جمع الخلايا عن طريق سكبها في أنبوب NOC سعة 50 milliliter ثم إجراء عملية الطرد المركزي بسرعة 1200 RPM لمدة 15 دقيقة. وبعد الطرد المركزي، يتم إزالة الوسط المزرعي عن طريق الشفط.

أضف خمسة ملليلترات من الوسط الزرعي لإعادة تعليق كتل الخلايا. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، خذ ما يقرب من 1×10⁷ من الخلايا وأكمل الحجم إلى 40 ملليلتر باستخدام وسط RPMI 1640 المحتوي على 10% FBS. ثم أضف 1.7 ملليلتر من الفورمالديهايد بتركيز 37% لتثبيت الكروماتين المخفف.

يُحضن sample في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع الرج الخفيف. بعد التحضين، يتم إيقاف التفاعل بإضافة 2.4 milliliters من glycine بتركيز two molar. بعد ذلك، يتم طرد sample مركزياً لمدة 15 دقيقة بسرعة 1200 RPM وعند درجة حرارة four degrees celsius.

بعد إزالة السائل الطافي، اغسل الراسب مرة واحدة باستخدام 40 milliliters من PBS المبرد بالثلج، ثم قم بطرد العينة مركزياً لاستعادة راسب الخلايا المغسول. أعد تعليق الراسب الناتج في 40 milliliters من منظم التحلل (lysis buffer) المبرد بالثلج مع إضافة مثبطات البروتياز الطازجة و 0.1 millimolar من PMSF، ثم حضن العينة في غرفة باردة مع التدوير لمدة 90 minutes. وأخيراً، قم بطرد العينة مركزياً بسرعة 2, 500 RPM لمدة 15 minutes، وأزل السائل الطافي للحصول على النوى المعزولة. أعد تعليق النوى في 0.5 milliliters من one XNEB buffer three وأضف 15 microliters من 10% SDS.

قم بحضن العينة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة مع الرج. ثم أضف 45 µL من Triton X 100 بتركيز 20% لعزل SDS، ثم احضنها مجدداً عند 37 °C لمدة ساعة واحدة مع الرج، مع تقسيم العينة إلى حصص بمقدار 1 × 10⁶. وتُستخدم النوى، أو ما يقرب من 15 µg، للهضم باستخدام إنزيم التقييد في 55 µL من محلول النوى.

أضف 433 µL من منظم NEB buffer 3 بتركيز 1X و12 µL من BGL 2. وللوصول إلى حجم إجمالي لتفاعل الهضم يبلغ 500 µL، يتم تحضين التفاعل عند 37 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم تثبيط إنزيم القطع بإضافة 95 µL من SDS بتركيز 10%، ثم يتم تغيير طبيعة الإنزيم بالتسخين عند 65 °C لمدة 20 دقيقة.

في حمام مائي، أضف سبعة ملليلتر من منظم الربط (ligation buffer) بتركيز 1x و 360 ميكرولتر من Triton X 100 بتركيز 20%. حضّن العينة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. اخفض درجة الحرارة إلى 16 °C وأضف 50 ميكرولتر بتركيز 400 وحدة لكل ميكرولتر.

أضف T four DNA Ligase. اترك تفاعل الربط ليتحضن عند درجة حرارة 16 درجة مئوية لمدة أربع ساعات، ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد اكتمال عملية الربط، أضف 300 micrograms من proteinase K واحضنه عند درجة حرارة 65 درجة مئوية طوال الليل.

بعد ذلك، أضف 5 µg من RNAA وقم بالتحضين عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. قم بتنقية DNA عن طريق الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم، ثم قم بترسيب DNA في isopropanol، وأذِب الـ DNA المترسب في 150 µL من الماء المقطر المعقم. ولإضافة الروابط (linkers) إلى DNA الخيمري، قم أولاً بهضم DNA عن طريق تحضين 2 µg من DNA المنقى مع 5 units من msp, one عند 37 °C لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات؛ وعقب عملية الهضم، قم بتعطيل MSP one عند 65 °C لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بترسيب الـ DNA في الإيثانول مع ميكرولتر واحد من الجليكوجين بتركيز خمسة مليغرام/ملل. قم بإذابة قرص الـ DNA الناتج في 50 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. بعد ذلك، اخلط 50 ميكرولتر من الـ DNA المعالج بـ MSP one مع ميكرولترين من أوليغونوكليوتيد الرابط L بتركيز 20 ميكرومولار وميكرولتر واحد من أوليغونوكليوتيد S بتركيز 20 ميكرومولار، ثم أضف ميكرولتر واحد من الماء المقطر المعقم وستة ميكرولتر من منظم T4 DNA Ligase بتركيز 10X.

قم بتغطية الخليط بالشمع السائل. قم بمسخ قليلات النوكليوتيد عند 50 °C لمدة دقيقة واحدة، ثم اتركها تبرد تدريجيًا حتى 10 °C بمعدل انحدار 0.5 °C في الدقيقة. باستخدام جهاز التدوير الحراري، أضف 1 µL من إنزيم T4 DNA ligase بتركيز 400 units/µL، ثم حضن التفاعل عند 15 °C طوال الليل.

في اليوم التالي، قم بتنقية الحمض النووي DNA المربوط بالوصلة باستخدام طقم تنقية PCR السريع من kaya، ثم استخله في 50 µL من الماء المقطر المعقم. اختر بادئة للمنطقة المحددة من DNA المراد فحص التفاعلات طويلة المدى فيها. في هذا المثال، سيتم استخدام Abel كبادئة أو كطعم.

قم بتجهيز الحمض النووي DNA المنقى للدورة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR عن طريق دمج 1 µL من الـ DNA المنقى مع 1 µL من بادئ نوعي 46 56 بتركيز 20 µM، و1 µL من بادئ الرابط النوعي 29 63 بتركيز 20 µM. ثم أضف 3 µL من مزيج ClinTech DNA polymerase one cocktail بتركيز 3x والذي تم خلطه مسبقًا مع 32 P-D-C-T-P وفقًا للبروتوكول المكتوب، يليه 3 µL من الماء المقطر المعقم. قم بإجراء تضخيم PCR باستخدام الدورة الحرارية hot start PCR الموضحة في البروتوكول المكتوب بعد اكتمال دورة PCR.

قم بتنقية نواتج تفاعل PCR للجولة الأولى باستخدام طقم تنقية PCR سريعة من kaya. قم باستخلاص النواتج في 30 µL من الماء المقطر المعقم. استخدم 1 µL من ناتج PCR الأول مخففاً بمقدار 100 مرة لإجراء جولة ثانية من تفاعل PCR باستخدام بادئات متداخلة (nested primers)، وذلك بإضافة 1 µL من بادئ نوعي لـ able one بتركيز 20 µM، 46 26، و1 µL من بادئ نوعي للرابط (linker) بتركيز 20 µM، 29 61.

مرة أخرى، أضف 3 µL من محلول ClinTech بتركيز 3x، وDNA polymerase، ومزيج تفاعل واحد (one cocktail)، و3 µL من الماء المقطر المعقم. قم بإجراء الجولة الثانية من تفاعل PCR باستخدام برنامج دورات حرارية مكون من 25 دورة تتضمن 95 °C لمدة 20 ثانية، و67 °C لمدة 40 ثانية، و72 °C لمدة دقيقة واحدة، تليها خطوة تمديد عند 72 °C لمدة خمس دقائق.

قم بتصور نواتج PCR عن طريق إجراء الفصل الكهربائي باستخدام هلام polyacrylamide يحتوي على 5% urea، ثم قم بمسح الشاشة المعرضة باستخدام جهاز التصوير الفسفوري (phospho imager). يمكن استعادة كل حزمة PCR من الهلام عن طريق إذابة شرائح الهلام في أنبوب eppendorf يحتوي على 60 µL من الماء المقطر المعقم والتحضين عند 95 °C لمدة خمس دقائق. ثم قم بطرد نواتج الهلام المذابة مركزياً لفترة وجيزة بسرعة 10,000 RPM لمدة 10 ثوانٍ.

لجمع كافة العينات، اسحب 1 µL لاستخدامه كقالب DNA لإجراء تفاعل PCR باستخدام بادئات الإصلاح 29 61 46 26.

باستخدام نفس الظروف الموصوفة أعلاه، يمكن إجراء تحليل التسلسل بعد التنقية باستخدام أداة عبر الإنترنت لتحديد الموقع الكروموسومي. بمجرد الدخول إلى موقع المعلوماتية الحيوية للجينوم، انقر فوق blatt لفتح نافذة جديدة ثم الصق تسلسل DNA. وبعد إرسال تسلسل DNA، ستظهر نتائج بحث BLATT.

انقر على المتصفح عند النتيجة التي تتطابق بنسبة 100% للكشف عن موقع تسلسل DNA. استُخدمت منطقة able one كطعم لتحديد تفاعلات DNA بعيدة المدى الخاصة بها. تم اختيار موقعين BGL II وموقع واحد BAM H I لاختبار A CT في الجولة الثانية من PCR؛ حيث استُخدمت مجموعة البادئات 46 26 29 61 لتضخيم able M1، واستُخدمت 46.30 29 61 لـ able M two، بينما استُخدمت 46, 36 29 61 لـ able M three.

يكشف نمط الهلام التقليدي عن وجود نطاق واحد أو عدة نطاقات كما هو موضح هنا لكل من able M1 و able M two و able M three. تم عرض تسلسل DNA للمستنسخ able M1 لتوضيح أن كل قطعة ناتجة عن مقايسة A CT تتكون من قطعتين مدمجتين من DNA؛ حيث تشتق إحدى القطعتين من منطقة DNA الطعم، بينما تأتي القطعة الثانية من الشريك المرتبط.

يتم ربط القطع ببعضها البعض بواسطة تسلسل التعرف الخاص بالإنزيم القاطع الأول. وسيظهر تسلسل التعرف للإنزيم الثاني في نهاية التسلسل الشريك المرتبط. تحتوي قطعة M1 المستنسخة على DNA من منطقة ABLE one الموجودة في الكروموسوم تسعة Q 32.4، بينما يقع الشريك المرتبط في الكروموسوم ثلاثة P ثلاثة، والذي تم تحديده على أنه proc two.

وبالمثل، تم تحديد موقع الشريك المرتبط بـ able M two على الكروموسوم five Q 21.1، بينما تم تحديد clone able M three كـ ارتباط داخل الكروموسوم بالقرب من locus ABLE one، وذلك على عكس مقايسات three C. ستعمل المنهجية الموضحة في هذا الفيديو على اختيار التفاعلات بعيدة المدى الأكثر انتشاراً. ومع ذلك، من خلال زيادة عدد دورات PCR R، يمكن أيضاً تحديد ارتباطات إضافية أقل تكراراً باستخدام منطقة البصمة والتحكم أو ICR في locus IGF two H 19 كـ bait DNA في خلايا mouse fiberblast، حيث تم تطبيق برامج دورات مختلفة في الجولتين الأولى والثانية من PCR في مقايسة A CT.

يمكن استخدام مقايسة A CT أيضاً لتحديد الاختلافات في البنية النووية والتفاعلات بعيدة المدى بين الخلايا الطبيعية والخلايا السرطانية. تم تجنيس أنسجة القولون الطبيعية وأنسجة سرطان القولون، وأُجريت مقايسة A CT باتباع الإجراءات الموضحة هنا. يظهر هنا تركيب DNA لمنطقة ICR في موقع IGF two H 19 وجين IGF two dpn.

تم تحديد موقعين لمقايسة A CT؛ حيث تم تمييز البادئات المستخدمة في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بأسهم وأرقام بألوان مختلفة. يمثل نمط الهلام لمقايسة A CT نتائج PCR باستخدام البادئ 29 61 مع أي من أزواج البادئات 41, 61، أو 41 63، أو 51 45، أو 51 51. تم تمييز الحزم الفريدة التي تظهر فقط في أنسجة القولون الطبيعية بأسهم صفراء، بينما تم تمييز الحزم التي ظهرت فقط في أنسجة سرطان القولون بأسهم حمراء بعد تطوير المقايسة.

تُمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السوق لاستكشاف البنية النووية والتنظيم الجيني بطريقة ثلاثية الأبعاد.