الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مواقع مسابر DNA على كروموسومات البعوض متعددة الخيوط (polytan chromosomes) باستخدام تحضير كروموسومي عالي الضغط، يليه تهجين فلوري آلي في الموقع (in situ) وتصوير آلي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير فروقات الكروموسومات متعددة الخيوط باستخدام طريقة الضغط العالي. الخطوة التالية من الإجراء هي تحضير مسابر فلورية عن طريق وسم DNA الجينومي بصبغة فلورية باستخدام بروتوكول نقل الثلمة (Nick translation).

تتمثل الخطوة الثالثة في إجراء تهجين متحد اللون في الموقع C (C2 hybridization) باستخدام أنظمة صبغ الشرائح الآلية. وتتمثل الخطوة النهائية في مسح وتصوير الكروموسومات الموُسمة باستخدام نظام تصوير فلوري آلي. وفي النهاية، يمكن أن توضح الصور موقع مسبار DNA الموُسم فلوريًا على الكروموسوم المتعدد.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل بروتوكول التهجين الموضعي اليدوي القياسي، في أن بروتوكول الخرائط الفيزيائية عالي الإنتاجية يعطي نتائج أكثر اتساقاً ويقلل بشكل كبير من الوقت المستغرق في العمل اليدوي. يبدأ هذا البروتوكول بتشريح إناث عن طريق الجاذبية النصفية فقط بعد حوالي 25 ساعة من التغذية بالدم لجمع المبايض عندما تكون في المرحلة الثالثة من تصنيف Christopher. في هذه المرحلة، يجب أن تكون المنطقة الشفافة التي تحتوي على الخلايا المغذية داخل الجريبات ذات شكل مستدير؛ اجمع المبايض من خمس إناث وثبّتها في 500 µL من محلول car noise المعدل المحضر حديثاً.

ويمكن بعد ذلك تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة، أو لفترة أطول في درجة حرارة -20 °C. بعد ذلك، وقبل البدء مباشرة في إعداد شرائح تشريح المبيض، قم بتحضير محلول car noise وحمض البروبيونيك بتركيز 50%. ضع كل زوج من المبيضان في قطرة من محلول car noise الطازج على شريحة خالية من الغبار تحت مجهر التشريح.

قم بشق المبيضين باستخدام إبرة التشريح. انقل جميع قطع المبيض إلى ست شرائح نظيفة تحتوي على حمض البروبيونيك بتركيز 50%. افصل الجريبات عن بعضها البعض باستخدام إبر التشريح.

بعد ذلك، امسح أي أنسجة متبقية باستخدام منشفة ورقية. أضف قطرة أخرى من حمض البروبيونيك (proponic acid) بتركيز 50% وانتظر لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. يرجى الملاحظة أن ترك الجريبات في حمض البروبيونيك (Proponic acid) بتركيز 50% لمدة ثلاث إلى خمس دقائق يحسن من عملية فرد الكروموسومات بشكل ملحوظ.

بعد ذلك، ضع شريحة غطاء وانتظر دقيقة أخرى لتوزيع النوى. قم بلف الشريحة بورق ترشيح وبلاستيك. اضبط جهاز دريميل (Dremel) على سرعة تتراوح بين 3 و 5,000 RPM، ولمدة دقيقة واحدة تقريباً، قم بتحريك رأس الدريميل الدوار بلطف وبشكل دائري فوق شريحة الغطاء.

تحقق من جودة انتشار الكروموسومات باستخدام مجهر تباين الأطوار، واستخدم أداة الدريمل لفترة أطول إذا لزم الأمر لتسطيح الكروموسومات. ضع شريحة غطاء ثانية بجوار الأولى، ثم قم بتثبيت شرائح الغطاء بين بعضهما باستخدام مجهر آخر. بعد ذلك، غلف الشرائح بلفافة بلاستيكية وورق ترشيح، ثم ضع الشرائح الملفوفة في ملزمة لضغطها بقوة تتراوح بين 85 و 120 inch pounds.

بعد تسوية الكروموسومات على جميع الشرائح الست، قم بإزالة الغلاف عن الشرائح واستبعد الشرائح الإضافية لزيادة تسوية الكروموسومات. قم بحضن الشرائح عند 55 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة في نظام تهجين مخصص لمسخ الحمض النووي على الشرائح. بعد ذلك، اغمس الشريحة في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية على الأقل أو حتى يتوقف ظهور الفقاعات.

ثم قم بإزالة غطاء الشريحة بسرعة باستخدام شفرة حلاقة، وضع الشريحة فوراً في إيثانول بارد بتركيز 50% لمدة خمس دقائق. كرر هذه العملية لكل شريحة بالتتابع. قم بتجفيف الشرائح في حمامات إيثانول بتركيزات 70% و90% و100%.

اغمرها في كل حمام لمدة خمس دقائق. وأخيرًا، بعد أن تجف الشرائح في الهواء، تصبح جاهزة للصباغة. يقوم جهاز آلي بتنفيذ معظم الخطوات في الإجراء باستثناء وسم المسبار.

لذا، قبل تحميل الجهاز، قم بتحضير المسبار الفلوري عن طريق وسم الـ DNA العكسي باستخدام الفلوروكروم باتباع بروتوكول ترجمة NIC تجاري، وبمجرد تحضير المسبار، قم بتحميل الشرائح والكواشف في نظام صبغ الشرائح الآلي وقم ببرمجة النظام لتنفيذ الخطوات التالية. أولاً، قم بإضافة 800 µL من 1xPBS لمدة 20 دقيقة.

ثانيًا، جفف الشرائح باستخدام مجفف الهواء. ثالثًا، ثبت الشرائح باستخدام 450 µL من 4% formalin في XPBS لمدة دقيقة واحدة. ثم اغسل الشرائح باستخدام 100% ethanol لمدة ثانية واحدة، مرتين، ولمدة دقيقتين.

بعد الانتهاء من حمام الإيثانول، قم بتجفيف الشرائح بالنفخ مرة أخرى. الآن قم بتسخين الشرائح عند 45 °C لمدة دقيقتين لتجنب تكون الفقاعات. بعد ذلك، ضع 20 µL من مسبار DNA، متبوعة بقطرة من الزيت المعدني وغطاء شريحة، ثم قم بتسخين الكروموسومات عند 90 °C لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، تُترك الشرائح للتهجين عند 42 °C لمدة 14 ساعة. وبعد عملية التهجين، تُجرى غسلات الصرامة لمدة دقيقتين عند 42 °C، تليها أربع تطبيقات متتالية لمدة ثانية واحدة من 2 XSSC ثم التجفيف. بعد ذلك، يُوضع 800 µL من 0.4 XSSC عند 42 °C لمدة 10 دقائق مرتين، يلي ذلك غسلة واحدة إضافية و2 XSSC عند 25 °C لمدة 10 دقائق.

الآن قم بوضع الصبغة، 50 µL من yo-yo one، يتبعها الزيت المعدني وأغطية الشريحة. حضن الشرائح عند 25 °C لمدة 10 دقائق، ثم قم بإزالة أغطية الشريحة.

اغسل الشرائح في محلول XSSC ثنائي التركيز أربع مرات، لمدة ثانية واحدة لكل غسلة، ثم جفف الشرائح باستخدام تيار هوائي. وأخيراً، ضع 15 µL من كاشف Prolonged Gold لمنع البهتان على كل شريحة وثبّت أغطية شرائح جديدة. قم بتشغيل نظام المسح الآلي Accord plus، بدءاً بمصدر طاقة Olympus U-R-F-L-T للمصباح الهالوجيني.

ثم الكمبيوتر، وأخيرًا المجهر المزود بملحق كاميرا. الآن، افتح حزمة برمجيات duet أولاً، وقم بإعداد مسح مسبق بقوة 10x. انقر فوق زر online، وأدخل معرف حالة (case ID) جديدًا وقم بتعيين معرف شريحة (slide id).

انقر على النقطة المسمى bf. هذا هو خيار الحقل المضيء (brightfield). اختر خيار المسح الضوئي 10 x pre-scan.

اختر 2, 500 x circle، أو 10, 000 x circle، أو rectangle. انقر على set ثم run. بعد ذلك، اتبع الإرشادات لضبط المسح بشكل صحيح، ثم انقر على finish.

لبدء المسح، اضغط على التبويب الرئيسي للعودة إلى الشاشة الرئيسية. الآن انقر فوق زر "offline"، ثم حدد معرف الحالة (case ID) ومعرف الشريحة (slide ID) اللذين تم تعيينهما، وانقر على "offline".

قم بعمل مسح للصندوق الأسود الموجود في المنطقة العلوية اليسرى. انقر فوق السهم واختر 10 x pre-scan. استخدم الأسهم للتنقل عبر الصور الممسوحة ضوئياً بعد العثور على الصورة المطلوبة.

انقر نقراً مزدوجاً على الشاشة في منتصف المنطقة المستهدفة ثم اضغط على snap. سيؤدي ذلك إلى تحديد صورة لالتقاطها لاحقاً بعد اختيار جميع الأهداف. انقر بزر الفأرة الأيمن على كل صورة، ثم انقر على classify واختر 10 x pre-scan ثم اختر polytan.

ارجع إلى القائمة الرئيسية وقم بإعداد المسح المسبق بـ 40x. اختر "online" مرة أخرى ثم اختر شريحة. قم بتغيير BF إلى ffl وتغيير اسم المهمة إلى revisit dash X 40 dash rg.

قم بتغيير القسم الموجود أسفل الإعداد الأخير مباشرةً ليكون revisit dash all. ثم قم بتشغيل البرنامج واتبع الإرشادات. لإعداد الأتمتة، انقر فوق زر start matching views لمطابقة الصور ذات التكبير 10x و 40x.

انقر فوق "إنهاء" لبدء الفحص. وبمجرد الانتهاء، انقر فوق "تصنيف" وافحص الصور. تم تحضير كروموسومات الخلايا الممرضة المعددة في المبيض من أنثى "anomaly Gambia" باستخدام تقنية الضغط العالي.

لا تؤدي هذه الطريقة إلى إتلاف أو تغيير معظم بنية الكروموسوم. فهي تعمل على تسوية الكروموسومات المنحنية، مما يكشف عن نطاقات دقيقة مخفية لا تظهر في التحضيرات العادية. وقد تم فحص الكروموسوم باستخدام مستنسخات DNA من مكتبة S Gambia nd Tam back الخاصة بالشذوذ.

تم إنشاء المكتبة من يرقات المرحلة الأولى الذكرية والأنثوية لسلالة آفة S Gambia الشاذة. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء رسم خرائط مادية مؤتمتة عالية الإنتاجية من أجل تسهيل التطوير السريع لتجميعات الجينوم القائمة على الكروموسومات.