Transcriptome تحليل خلايا مفردة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير عينات من خلايا مفردة لتحليل النسخ (transcriptome analysis). ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إيجاد خلية مناسبة للعزل، ثم توضع الماصة الدقيقة بجوار الخلية المراد عزلها.

بعد ذلك، يتم تطبيق الشفط على المحقنة حتى يتم سحب الخلية إلى طرف الماصة الدقيقة. والخطوة النهائية من الإجراء هي كسر طرف الماصة الدقيقة داخل أنبوب الجمع وتفريغ المحتويات المتبقية من الماصة الدقيقة في الأنبوب. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر الاختلافات في مجموعات mRNA بين الخلايا من خلال تحليل المصفوفات الدقيقة للمواد التي تم تضخيمها باستخدام طريقة تضخيم arna، الموضحة أيضاً في البروتوكول، أو لتطبيقات أخرى مثل PCR أو تسلسل الجيل التالي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية وفهمًا للاختلافات بين الخلايا المفردة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على المكونات دون الخلوية مثل الشجيرات العصبية أو فئات من الشجيرات العصبية، وتوفير معلومات مهمة حول وظيفة الشجيرات العصبية. ستقوم جينيفر سينغ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. قبل البدء في هذا البروتوكول، تم استزراع عصبونات أولية من حصان البحر لجرذان في اليوم الجنيني 18 على شرائح غطاء قطرها 12 مليمتر في طبق قطر 35 مليمتر، وحُفظت كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ولتحضير الماصات لعملية الحصاد، استخدم ساحب الماصات الدقيقة لسحب ماصات زجاجية معقمة بجهاز الأوتوكلاف إلى قطر مناسب لعلم الفيزيولوجيا الكهربائية.

باستخدام البرنامج المسبق الضبط من الشركة المصنعة، لا يكون حجم الفتحة حرجاً لأن الطرف سيتم كسرُه قبل جمع الخلايا. تُحفظ الماصات بعناية في بيئة خالية من الغبار، مثل جرة تخزين الماصات الدقيقة، حيث تظل الأطراف سليمة حتى يحين وقت حصاد الخلايا. يتم تحضير العدد المطلوب من أنابيب einor سعة 1.7 milliliter عن طريق إضافة 2 µL من PBS لتخزين المواد المحصودة.

أخرج طبقاً واحداً بقطر 35 مليمتر يحتوي على شرائح غطاء من الحاضنة داخل غطاء تدفق هوائي لزراعة الأنسجة. انقل بسرعة شريحة غطاء واحدة من هذا الطبق إلى غطاء طبق جديد بقطر 35 مليمتر يحتوي على HBSS. من الضروري إعادة شرائح الغطاء التي لا يتم التعامل معها إلى الحاضنة لأن الخلايا تصبح غير صحية.

في حال تركها لفترات زمنية طويلة. يلزم استخدام مجهر ضوئي مقلوب مزود بعدسة شيئية 40 x ومجهز بجهاز تلاعب دقيق (micro manipulator) لجمع الخلايا. استخدم حامل ماصة مع أنابيب مرنة تمتد بعيداً عن الحامل، وقم بتثبيت هذه الأنابيب على سطح مستقر لمنع أي حركة غير مرغوب فيها للماصة أثناء عملية الجمع.

عند نهاية الأنبوب، أدخل إبرة بحيث يمكن توصيل وتبديل سرنجة سعة 1 mL ذات وصلة قفل لور (lure lock) بين المستخدمين. جهز الماصة الدقيقة (micro pipette) عن طريق كسر الطرف بطريقة محكومة، وذلك بشد منديل كيم (Kim wipe) بين أصابع يد واحدة، ثم تحريك طرف الماصة برفق شديد فوق الورقة من مرة إلى مرتين. يجب أن تكون الفتحة تقريبًا من 75 إلى 100% من حجم الخلية المستهدفة.

قم بتثبيت الماصة الدقيقة في حامل الماصة الدقيقة، ثم ثبّت حامل الماصة الدقيقة في الجزء المخصص له في الملاعب الدقيقة. وأخيرًا، اضبط العدسة الشيئية 40x. ضع الطبق على منصة المجهر وحدد منطقة من الخلايا المناسبة للحصاد.

في حالة المزارع العصبية الأولية، يجب أن تكون الخلية معزولة نسبيًا عن الخلايا المجاورة لها. ولمنع جمع الخلايا المحيطة أو استطالاتها، ضع الخلية المراد جمعها في مركز مجال الرؤية. استخدم الميكرومانيبولاتور (المُحرك الدقيق) لتقديم الماصة الدقيقة نحو المحلول الموجود في الطبق باتجاه مسار الضوء.

أدخل طرف الماصة في المحلول. عند النظر عبر العدسة العينية، يجب أن تظهر الماصة كظل في مجال الرؤية. ابدأ من هذه النقطة بتطبيق ضغط إيجابي عن طريق النفخ بخفة عبر المحقنة فوق مستوى الخلايا بكثير.

اضبط موضع طرف الماصة حتى يصبح ضمن مجال الرؤية، ثم ركز على طرف الماصة باستخدام مقابض الضبط الخشن. في هذه المرحلة، تحقق مما إذا كان قطر تجويف الماصة كبيراً جداً أو صغيراً جداً. إذا كان قطر التجويف غير صحيح، استبدلها بماصة دقيقة أخرى حتى يتم العثور على القطر الصحيح، وذلك لمنع كسر الماصة في منطقة التجميع.

استخدم مقبض التركيز الخشن لتحريك المستوى البؤري قبل تقريب طرف الماصة نحو الخلايا باستخدام الميكرو-مناورات. ومع اقتراب الخلايا، استخدم التركيز الدقيق حتى يصبح كل من الخلايا وطرف الماصة في بؤرة التركيز. توقف عن تطبيق الضغط الإيجابي قبل الوصول إلى الخلايا المستهدفة لتجنب دفعها بعيداً عن شريحة التغطية.

قم بتحديد موضع طرف الماصة باستخدام أدوات التحكم الدقيقة بحيث يلامس جسم الخلية المراد جمعها. وباستخدام السرنجة، قم بتطبيق شفط خفيف عن طريق الفم حتى تدخل الخلية في طرف الماصة. إذا لم تدخل الخلية في الماصة، حرك الطرف بلطف ليكون أقرب إلى الخلية وإلى الأسفل حتى ترفعها من شريحة التغطية.

استخدم المجهر المناول لنقل الماصة فوراً إلى الأعلى وإخراجها من المحلول. قم بإزالة الماصة من الحامل. أمسك أنبوب "إينور" (einor) المُجهز بسعة 1.7 milliliter في يد واحدة، واكسر طرف الماصة برفق على جانب الأنبوب باتجاه القاع.

مع توجيه الطرف المكسور ليكون في المركز داخل الأنبوب ومستهدفاً علامة 0.1 milliliter، أدخل إبرة متصلة بمحقنة سعة one milliliter في الفتحة العلوية للماصة. اضغط المكبس بسرعة، مما يؤدي إلى دفع المحلول الموجود في الماصة ليرش داخل الأنبوب. احرص على عدم ملامسة الطرف لأي سائل على جدران الأنبوب.

بما أن الخاصية الشعرية ستعيد السائل إلى الماصة، يجب أن تظل الخلية في طرف الماصة تماماً، ويكون ذلك كافياً لطرد الخلية بشكل صحيح. قم بتدوير محتويات الأنبوب بسرعة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مكتبي (micro fuge)، ثم قم بتجميدها على الثلج الجاف أو وضعها على الثلج لمزيد من المعالجة أو لتطبيقات أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو تسلسل الجيل القادم. يظهر هنا مثال لعملية حصاد ناجحة لعصبون معزول.

للبدء، تم اختيار منطقة ذات كثافة خلوية منخفضة نسبيًا. ثم تم تحريك طرف الماصة نحو الخلية المطلوبة. يظهر هنا مجال الرؤية بعد حصاد الخلية.

لاحظ أن العمليات المحيطة تظل على غطاء الشريحة. وعلى العكس من ذلك، يوضح هذا الشكل صورتين لرؤوس ماصات ذات حجم غير مناسب للحصاد الفعال. سيؤدي هذا الرأس إلى حصاد غير مكتمل، بينما سيؤدي الرأس الموضح هنا إلى حصاد الوسط المحيط.

بعد الحصاد، يُوصى بإجراء تحليل تضخيم الـ RNA باستخدام جهاز bioanalyzer لفحص توزيع وكمية الـ RNA المضخم. سينتج عن التضخيم الناجح للمواد المستخلصة من خلية واحدة كميات إجمالية في نطاق الميكروغرامات المنخفضة، وسيكون لها توزيع سلس وواسع. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح؛ وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام تقنية خالية من الـ RNA.