نهج لدراسة النسخ المعتمدة على الشكل على مستوى خلية واحدة
نوفمبر 2, 2020
تعرض هذه الورقة طرقًا لنمو الخلايا القلبية ذات الأشكال المختلفة ، والتي تمثل أمراضًا مختلفة ، وفرز هذه الخلايا القلبية المؤمنة استنادًا إلى مورفولوجياها على مستوى خلية واحدة. توفر المنصة المقترحة نهجًا جديدًا في الإنتاجية العالية وفحص الأدوية لأنواع مختلفة من قصور القلب.
نقترح منصة جديدة للتحقيق في آثار شكل الخلية على التعبير الجيني، وذلك باستخدام أساليب لزراعة وفرز التمسكات مع morphologies مختلفة على مستوى الخلية الواحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسهل دراسة عالية الإنتاجية من شكل الخلية في المختبر كما مقارنة الخلايا مع أشكال مختلفة في الجسم الحي يتطلب من الناحية الفنية. لإعداد ثقافة cardiomyocyte منقوشة، نقل تعليق cardiomyocyte في نسبة العرض إلى الارتفاع من الفائدة إلى أنبوب 15 ملليلتر لحساب وتمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخمس لكل ملليلتر من التركيز المتوسط الطلاء المناسب.
إضافة ملليلترين من الخلايا على رقاقة micropatterned المغلفة الليفية المغمورة في مليلترين من المتوسطة الطلاء الدافئ داخل طبق 35 ملليلتر غرينييه بيتري ووضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة. في اليوم التالي، تحقق من الشريحة عن طريق المجهر الخفيف للتأكد من أن معظم الخلايا قد تعلق. إزالة المتوسطة من الطبق لإزالة أي حطام وخلايا ميتة، وبدءا من المركز والتحرك نحو الجانبين بطريقة قطرة الحكمة، بلطف إضافة برنامج تلفزيوني إلى الخلايا.
بعد الغسيل الثالث، استبدل برنامج تلفزيوني بـ 4 ملليلتر من متوسط الصيانة وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. بعد 72 ساعة، تدفق بلطف سطح رقاقة مرتين مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني دافئ Dulbecco في غسل كما هو موضح واستخدام ملقط لنقل على الفور رقاقة غسلها إلى طبق جديد معقمة 35 ملليلتر غرينييه بيتري. إضافة بسرعة 1.5 ميكرولترات من ثنائية خضراء نابضة بالحياة المخفف 1000 أضعاف في DPBS إلى الشريحة.
إصلاح غرفة على رقاقة ووضع الطبق على حامل طبق من مرحلة منتقي الخلية. أدخل الغطاء المغناطيسي وحدد موقع التقاطع في نافذة المنظر المباشر. التركيز على التقاطع، وفي إطار المسح الضوئي والفرز، حدد المعايرة للحقن التلقائي ومعايرة.
استبدل الطبق المكبر بـ 1.5 ملليلتر من E ثلاثية واحدة في حل DPBS لتخفيف الخلايا من الليفية وفتح علامة التبويب المسح الضوئي. لمسح رقاقة كاملة، والتركيز على الزاوية اليسرى العليا من رقاقة في مجال الرؤية وانقر فوق الحصول على موقف المجهر الحالي. المقبل، والتركيز على أسفل الزاوية اليمنى من رقاقة وانقر فوق الحصول على موقف المجهر الحالي.
في النافذة المنبثقة، انقر فوق تعيين الطائرة الأكثر حدة وانقر على الانتقال إلى أعلى اليمين والذهاب إلى أسفل أزرار الزاوية اليسرى. ثم انقر فوق إنهاء لبدء المسح الضوئي. عند اكتمال المسح الضوئي، افتح علامة التبويب التحليل وانقر فوق إظهار الخريطة لتحديد الخلايا المفردة التي تجتاز معايير الدراسة.
مركز الزجاج microcapillary في منتصف المجهر عرض العيش وفتح التبويب مضخة. لخلق فراغ، تراجع المكبس من 50 ملليلتر عدد حقنة واحدة أربعة ملليلتر وفتح علامة التبويب الفرز. للسماح بانتقاء خلية واحدة، قم بتعيين الصمامين لفتحهما لمدة 120 مللي ثانية، وفتح صمام واحد لمدة 20 مللي ثانية بعد مرور 200 مللي ثانية.
للسماح بتسليم الخلية التي تم اختيارها بنجاح إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على عازلة تحلل، تعيين صمام واحد ليتم فتحه لمدة 20 مللي ثانية والصمام الثاني ليتم فتحه لمدة 10 مللي ثانية بعد مرور فترة زمنية من 10 مللي ثانية. عند ضبط إعدادات الصمام، انقر فوق حساب المسار. البرنامج سوف يحسب أسرع مسار من خلية إلى خلية لالتقاط وحقن الخلايا المحددة في جميع أنحاء رقاقة.
ثم، ركز المجهر على نمط على سطح الشريحة. استخدام عصا التحكم لتحريك microcapillary إلى أسفل بعناية بحيث يمكن الحصول على صورة حادة من غيض من microcapillary دون لمس سطح رقاقة وانقر فوق مجموعة. سيتم فتح نافذة جديدة، تظهر المقطع العرضي للكابيلات الصغيرة.
لجعل البرنامج يسجل إزاحة تلميح من الشعرية في X و ص و Z الإحداثيات، انقر على مركز الدقيق من الشعرية. ثم انقر فوق بدء الفرز لبدء الفرز. في هذا التحليل التمثيلي لـ cDNA المُكبرة مسبقًا من خلية مفردة منتقى ، لوحظ وجود نطاق واضح في مؤامرة قياس الكثافة مثل الجل المقابل للذروة عند 1 ، 852 زوجًا أساسيًا في المخطط الكهربائي.
كان متوسط حجم الأجزاء 1, 588 أزواج قاعدة مع عدد صغير من الأجزاء التي كانت أقصر من أزواج قاعدة 300, تشير إلى إنشاء مكتبة cDNA جيدة. يمكن أيضًا إجراء التلطيخ والتحليل المناعي لتقييم بنية السارومور داخل الخلايا القلبية المنقوشة. هذه المنصة تمهد الطريق لدراسة عالية الإنتاجية وفحص المخدرات من أنواع مختلفة من فشل القلب.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة منصة مبتكرة لزراعة وفرز الخلايا العضلية القلبية بناءً على شكلها المورفولوجي على مستوى الخلية الواحدة. تتيح هذه الطريقة إجراء فحص دوائي عالي الإنتاجية لأنواع مختلفة من فشل القلب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- زراعة الخلايا العضلية القلبية
- تحليل مورفولوجيا الخلايا
- منهجيات فحص العقاقير
خلفية علمية
- تظهر الخلايا العضلية القلبية أشكالاً متنوعة ترتبط باعتلالات مرضية مختلفة.
- يُعد استقصاء تأثيرات شكل الخلية على التعبير الجيني أمراً صعباً في الجسم الحي (in vivo).
- تعتبر التقنيات عالية الإنتاجية أساسية للفحص الفعال للعقاقير.
- تفتقر الطرق الحالية إلى الكفاءة في فرز وتحليل الخلايا المفردة بناءً على المورفولوجيا.
الغرض من الدراسة
- تطوير منصة لدراسة تأثير شكل الخلية على التعبير الجيني.
- تسهيل فرز الخلايا العضلية القلبية بناءً على شكلها المورفولوجي.
- تحسين عمليات فحص الأدوية لعلاجات فشل القلب.
الطرق المستخدمة
- تحضير وتخفيف معلق الخلايا العضلية القلبية.
- استخدام رقائق ذات أنماط مجهرية مطلية بالفبرونكتين لاستزراع الخلايا.
- استخدام المجهر الضوئي للتأكد من التصاق الخلايا.
- المسح الآلي وفرز الخلايا المفردة باستخدام نظام الشعيرات المجهرية.
النتائج الرئيسية
- الالتصاق الناجح للخلايا القلبية المنقوشة والحفاظ عليها.
- توليد مكتبة cDNA جيدة من الخلايا المفردة التي تم فرزها.
- كشف التلوين المناعي الفلوري عن هياكل القسيم العضلي (sarcomere).
- تدعم المنصة الدراسات عالية الإنتاجية وفحص العقاقير.
الاستنتاجات
- توفر المنصة المطورة نهجاً جديداً لدراسة الخلايا العضلية القلبية.
- تتيح هذه المنصة فرز الخلايا وتحليلها بكفاءة بناءً على المورفولوجيا.
- يمكن لهذه الطريقة أن تدفع عجلة الأبحاث في علاجات فشل القلب بشكل كبير.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح هذه المنصة إجراء استقصاء منهجي حول كيفية تأثير مورفولوجيا الخلايا العضلية القلبية على التعبير الجيني، مما يعالج فجوة حرجة في فهم التنظيم الترانسكريبتومي المعتمد على الشكل في حالات فشل القلب. ومن خلال ربط الأنماط المورفولوجية الهندسية المحددة بالأنماط الظاهرية المرضية، مثل اعتلال عضلة القلب الضخامي والمتوسع، فإنها توفر جسراً ميكانيكياً بين البنية الخلوية وإشارات نقل الإشارة ذات الصلة بالمرض. ويدعم هذا النهج التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة والمسح المظهري من خلال توليد بيانات ترانسكريبتومية أحادية الخلية قابلة للتكرار ومصنفة مورفولوجياً، وذلك لتقليل المخاطر المرتبطة بالفرضيات العلاجية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح اختبار الفرضيات العلاجية من خلال ربط نسب العرض إلى الارتفاع المحددة للخلايا العضلية القلبية بملفات التعبير الجيني المرتبطة بإعادة التشكيل المرضي.
- القيمة التشغيلية: تسهل عملية تقليل المخاطر البيولوجية من خلال عزل الخلايا المفردة والتحليل النسخي الموحد والمتحكم في المورفولوجيا.
- القيمة التنبؤية: تدعم عملية فرز المحفظة الدوائية من خلال تحديد البصمات الجزيئية المعتمدة على الشكل والتي قد تتنبأ بفعالية المركبات عبر الأنواع الفرعية لقصور القلب.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها بنسب عرض إلى طول دقيقة لعمليات فحص المركبات اللاحقة في نماذج فشل القلب.
- القيمة التشغيلية: ضمان توحيد المقايسات وقابلية تكرارها عبر رقائق الفيبرونكتين ذات الأنماط المجهرية التي تفرض شكلاً مورفولوجياً متسقاً للخلايا عبر المكررات.
- القابلية للتوسع: دعم الفحص عالي الإنتاجية من خلال الالتقاط الآلي للخلايا المفردة وحقنها في محلول التحلل للمعالجة المتوازية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين الترانسكريبتوميات الطبقية المورفولوجية في مرحلة الاكتشاف وبين التحقق قبل السريري من خلال نمذجة الأشكال الهندسية المرتبطة بـ HCM وDCM.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يتيح تحديد البصمات الترانسكريبتومية المعتمدة على الشكل والتي قد تعمل كمؤشرات تنبؤية للاستجابة العلاجية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يدعم اتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال الكشف عن كيفية تعديل شكل الخلية لتنشيط المسارات استجابةً للاضطراب الدوائي.
تكامل المسارات وسير العمل
تندمج هذه الطريقة في تسلسل عملية الاكتشاف من خلال تمكين تحليل قائم على الفرضيات لتأثيرات شكل الخلية قبل تحديد المركبات الرائدة، حيث تساهم المخرجات في توجيه اختيار النماذج قبل السريرية واستراتيجيات تقليل المخاطر الآلية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم الحد من المخاطر الميكانيكية عن طريق عزل متغير شكل الخلية لتوضيح دوره في التنظيم النسخي تحت الظروف الطبيعية والمرضية.
- الفحص: توفر مجموعات من الخلايا العضلية القلبية محددة المورفولوجيا وجاهزة للمقايسة، وذلك لتقييم المركبات بشكل موثوق في اكتشاف أدوية فشل القلب.
- التحليلات: تولد قياسات ترانسكريبتومية كمية للخلية الواحدة تسمح بمقارنة التعبير الجيني عبر أنماط مورفولوجية هندسية متميزة.
- الأبحاث الانتقالية: توفر نمذجة لأنظمة ذات صلة بالمرض تُمثل التضخم المركزي واللامركزي من خلال نسب باعية محكومة، مما يعزز الاستمرارية في الدراسات قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لحملات الفحص التكرارية عبر أنماط متعددة لفشل القلب ومكتبات المركبات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض في كيفية تأثير المورفولوجيا الخلوية على مسارات التأشير.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والتوحيد القياسي من خلال الزراعة ذات الأنماط الدقيقة والتعامل الآلي مع الخلايا المفردة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين الكشف المبكر عن الاستجابات البيولوجية المعتمدة على الشكل والتي قد تشير إلى القابلية للنقل السريري.
- تأثير المحفظة: تدعم ترتيب أولويات المركبات المعدلة حسب المخاطر بناءً على تأثيراتها عبر نماذج الخلايا العضلية القلبية المصنفة مورفولوجياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا القلبية، وتقنيات التنميط الدقيق، وأنظمة التعامل مع الخلايا المفردة.
- يعتمد على توفر رقائق منمطة دقيقاً ومطلية ببروتين الفيبرونيكتين، ومجهر فلوري، وأجهزة آلية لالتقاط الخلايا تعتمد على الشعيرات الدقيقة.
- يستلزم توحيد معايير تعريفات نسبة العرض إلى الارتفاع ومسارات تحليل الترانسكريبتوم بين الفرق لضمان اتساق التفسيرات.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند توسيع نطاق المنصة لتشمل أنواعاً أخرى من الخلايا أو نماذج أمراض أخرى بخلاف الخلايا العضلية القلبية.
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى تحسين كثافة الخلايا وأوقات الحضن لضمان الالتصاق الموحد عبر الأنماط الدقيقة.
