iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على خريطة واسعة النطاق للترانسكريبتوم توضح مواقع ارتباط بروتين رابط للحمض النووي الريبي (RNA binding protein) بدقة النيوكليوتيد الواحد. ويتم تحقيق ذلك عن طريق التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية (UV) للخلايا الحية لربط البروتينات والـ RNA تساهمياً داخل الجسم الحي (in vivo) كخطوة ثانية. ثم يتم تنقية البروتين الرابط للـ RNA مناعيًا تحت ظروف صارمة من أجل استعادة شظايا الـ RNA المرتبطة تساهميًا.

يؤدي النسخ العكسي التالي إلى توليد cDNA غالبًا ما ينقطع عند الببتيد المرتبط، مما يحافظ على المعلومات المتعلقة بموقع الربط التشابكي داخل الـ RNA. ويتم الحصول على نتائج توضح جميع مواقع الارتباط ضمن الترانسكريبتوم بناءً على التسلسل عالي الإنتاجية لمكتبة cDNA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا الـ RNA، مثل كيفية تنظيم التفاعل بين بروتينات الـ RNA المختلفة لمعالجة الـ RNA. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في زيادة كل من أداء ودقة خرائطنا لتفاعلات البروتين والـ RNA على نطاق الترانسكريبتوم بأكمله. للبدء في إجراء الربط التشابكي بالأشعة فوق البنفسجية (UV cross-linking) لخلايا المزرعة النسيجية.

قم بإزالة الوسط من طبق بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على خلايا healer. أضف ستة ملليلتر من محلول PBS البارد جداً وضع الأطباق على الثلج. يكفي طبق واحد لإجراء ثلاث تجارب.

ارفع الغطاء وقم بتعريض الخلايا للإشعاع. بمجرد ضبط الطول الموجي عند 254 nanometers وبقدرة 150 millijoules per centimeter squared، يتم حصاد الخلايا عن طريق كشطها من الأطباق باستخدام أداة رفع الخلايا (cell lifter)، ثم انقل 2 mL من معلق الخلايا إلى كل أنبوب من ثلاثة أنابيب دقيقة لترسيب الخلايا. قم بطردها مركزياً بالسرعة القصوى لمدة 10 seconds عند درجة حرارة 4 °C.

ثم قم بإزالة مشبك السوبرناتانت، وجمد كرات الخلايا على الثلج الجاف وخزنها في درجة حرارة -80 °C حتى وقت الاستخدام. أضف 100 µL من بروتين dyna beads لكل تجربة إلى أنبوب دقيق نظيف. في حال العمل مع أجسام مضادة من الفأر أو الماعز، استخدم protein G dyna beads.

اغسل الخرزات مرتين باستخدام محلول التحلل (lysis buffer)، والذي يمكن العثور عليه في البروتوكول المكتوب المرفق. أعد تعليق الخرزات في 100 µL من محلول التحلل مع إضافة من 2 إلى 10 µg من الجسم المضاد. قم بتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة.

بعد ذلك، اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام 900 µL من محلول التحلل (lysis buffer)، واتركها في الغسلة الأخيرة حتى تصبح جاهزاً للمتابعة. ومن أجل الترسيب المناعي، ضع خلايا Thor على الثلج، ثم أعد تعليقها في 1 mL من محلول التحلل وانقلها إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 mL.

قم بتحضير تخفيف بنسبة 1 إلى 500 من RNAs one. ثم أضف 10 µL مع 2 µL من turbo DNAs إلى cell.Lysate. قم بحضن العينات لمدة ثلاث دقائق بالضبط عند 37 °C، مع الرج بسرعة 1,100 دورة في الدقيقة، ثم انقلها فوراً إلى الثلج.

ثم يتم طرد العينات مركزياً عند درجة حرارة 4 °C وبقوة 22,000 ×g لمدة 20 دقيقة لتصفية المستخلص الخلوي، ثم تُجمع المادة الطافية بعناية، مع ترك حوالي 50 µL من المستخلص الخلوي مع الراسب لترسيب الخرز مناعياً. يُزال محلول الغسيل، ثم تُضاف المستخلصات الخلوية المُحضرة. تُدوّر العينات لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C.

تخلص من عامل SUP واغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 µL من منظم الملح العالي (high salt buffer)، والذي يمكن العثور عليه في البروتوكول المكتوب المرفق. وأخيراً، اغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 µL من منظم الغسيل (wash buffer). ثم انتقل بعد ذلك إلى إزالة الفوسفات وإضافة رابط إلى النهايات الثلاثية (three prime ends) لجزيئات RNA.

لتوسيم النهايات الخمسية لـ RNA، يتم العمل خلف درع من البلكسي جلاس. قم بإزالة المادة الطافية من الغسلة الأخيرة لتفاعل ربط الوصلة، ثم أعد تعليق الحبيبات في 8 µL من مزيج PNK الساخن. قم بالتحضين لمدة خمس دقائق عند 37 °C.

قم بإزالة خليط PNK الساخن وأعد استخدامه. علّق الخرز في 20 µL من محلول تحميل الصفحة بتركيز 1x. بعد ذلك، قم بحضن العينة في جهاز خلط حراري (thermo mixer) عند درجة حرارة 70 °C لمدة 10 دقائق.

ضع العينة فوراً على مغناطيس لترسيب الحبيبات الفارغة. قم بتحميل العينات على هلام PAGE بنسبة من 4 إلى 12% وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

كذلك، قم بتحميل 5 µL من مؤشر حجم بروتيني مصبغ مسبقاً. قم بتشغيل الهلام لمدة 50 دقيقة عند 180 فولت. انقل معقدات البروتين و RNA من الهلام إلى غشاء نيتروسليلوز باستخدام جهاز النقل الرطب NOVA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد عملية النقل، اشطف الغشاء في محلول PBS المنظم. ثم قم بلفه بغشاء Saran البلاستيكي وعرّضه للفيلم عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. قم بإجراء عمليات التعريض لمدة 30 دقيقة، وساعة واحدة، وطوال الليل.

بعد ذلك، قم بعزل منطقة الغشاء وفقاً لمعقدات البروتين وRNA من عينات الـ RNAs المنخفضة. أجْرِ التجربة باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي كقناع. استعد الـ RNA من الغشاء عن طريق الهضم بإنزيم proteinase K والاستخلاص بالفينول والكلوروفورم.

قم بإجراء النسخ العكسي للـ RNA باستخدام أحد بادئات AYP لتنقية الـ CDNA باستخدام الهلام. اخلط 6 µL من عينة الـ CDNA مع 6 µL من محلول تحميل TBE urea بتركيز 2x، وذلك مباشرة قبل تحميل العينات على الهلام.

سخّن العينات عند 80 °C لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بتحميل العينات على هلام urea-TBE بنسبة 6% مصبّ مسبقاً مع دليل وزن جزيئي منخفض. اترك الهلام ليعمل لمدة 40 دقيقة عند 180 فولت كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة، مع استخدام صبغة التتبع العلوية والعلامات الموجودة على دعامة الهلام البلاستيكية لتوجيه عملية الاستئصال.

قم بقص ثلاث حزم عند 120 إلى 200 نيوكليوتيد، و85 إلى 120 نيوكليوتيد، و70 إلى 85 نيوكليوتيد. لاحظ أن بادئ arc lip وتسلسل L three يشكلان معاً 52 نيوكليوتيد من تسلسل clip. أضف 400 µL من te وقم بتفتيت شريحة الهلام إلى قطع صغيرة.

باستخدام مكبس محقنة سعة 1 mL، قم بحضن قطع الهلام مع الرج بسرعة 1,100 rotations per minute لمدة ساعتين عند 37 °C. ضع مرشحين زجاجيين أوليين بحجم 1 cm في عمود CoStar spinx. انقل الجزء السائل من العينة إلى العمود ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بسرعة 13,000 rotations per minute في أنبوب سعة 1.5 mL.

أضف 0.5 µL من glyco blue و 40 µL من خلات الصوديوم بـ pH 5.5. ثم اخلط العينة. أضف 1 mL من الإيثانول بتركيز 100%.

امزج المزيج مرة أخرى وقم بترسيب العينة طوال الليل عند درجة حرارة 20- درجة مئوية. وأخيراً، قم بجعل جزيئات CD NA دائرية لربط منطقة المهايئ (adaptor region) بالنهاية الخمسية (five prime end). بعد ذلك، قم بإعادة الخطية (re linearize) والتضخيم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR amplify) وفقاً للبروتوكول المكتوب المرفق قبل تسلسل مكتبة eye clip، ويمكن مراقبة نجاح التجربة في خطوتين.

يُظهر التصوير الشعاعي الذاتي لمعقد البروتين وRNA بعد النقل إلى الغشاء وصورة الهلام لنواتج تفاعل PCR في التصوير الشعاعي الذاتي لعينات RNA المنخفضة نشاطاً إشعاعياً منتشراً فوق الوزن الجزيئي للبروتين بالنسبة لعينات RNA العالية. ويكون هذا النشاط الإشعاعي مركزاً بشكل أقرب إلى الوزن الجزيئي للبروتين. وعندما لا يتم استخدام جسم مضاد في عملية الترسيب المناعي، لا ينبغي اكتشاف أي إشارة.

تتضمن الضوابط الهامة الإضافية لضمان نوعية الترسيب المناعي إما تعريض العينات للأشعة فوق البنفسجية (UVE irradiation) أو استخدام خلايا لا تعبر عن البروتين المستهدف. يجب أن تظهر صورة الهلام لنواتج PCR نطاقاً من الأحجام يتوافق مع جزء الـ CD NA. يرجى ملاحظة أن بادئات PCR، وهي P three Celexa و P five Celexa، تضيف 76 نيوكليوتيدات إضافية إلى حجم الـ CD NA. وفي حال عدم استخدام جسم مضاد أثناء عملية الترسيب المناعي، فلا ينبغي اكتشاف أي ناتج PCR مطابق.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن كل خطوة من الخطوات الـ 64 هي خطوة حاسمة ويجب تنفيذها بدقة مائة بالمائة. يمكن دمج بيانات ICL حوسبياً مع المقايسات الوظيفية على نطاق الترانسكريبتوم (transcriptum). ويمكن لهذا، على سبيل المثال، أن يوفر رؤى حول التنظيم المعتمد على الموقع لمعالجة RNA.

لإجراء تحليل البيانات الحسابي، نود الإحالة إلى منشوراتنا الأخيرة بالتعاون مع Nicholas KA في المعهد الأوروبي للمعلوماتية الحيوية وbla zupan في جامعة Liana. والآن حان الوقت لتبدأ تجاربك الخاصة. نتمنى لك التوفيق.