الطعوم الوعائية الهندسة البيولوجية ، عن طريق بناء مفاعل حيوي نابض

الهدف العام من هذا الإجراء هو هندسة طعوم وعائية حيوية باستخدام نظام مفاعل حيوي نبضي. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير سقالة قابلة للتحلل الحيوي من شبكة PGA حيث ستنمو الخلايا، ثم تجميعها في غرفة المفاعل الحيوي. بعد ذلك، يتم استزراع السقالات بخلايا العضلات الملساء، ويتم إغلاق غرفة المفاعل الحيوي بغطاء يحتوي على سدادات لأنبوب الهواء وأنبوب التغذية.

يتم بعد ذلك توصيل المفاعل الحيوي بنظام تدفق لتوفير تدفق نبضي للأوعية الموجودة داخل المفاعل الحيوي. وتنمو الخلايا في المفاعل لتشكل أوعية تجتاز الاختبارات المناعية الكيميائية والكيميائية الحيوية والميكانيكية. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج مرض الشريان التاجي، حيث تُعد هذه التقنية نهجاً واعداً لتجديد طعوم وعائية صغيرة القطر قابلة للزرع لعمليات تحويل الشرايين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الهندسة الوعائية، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنظمة أعضاء أخرى تخضع لقوى فسيولوجية دورية. وبشكل عام، سيواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات؛ لذا ستحتاج إلى الكثير من التدريب لإتقان هذه المهارات بشكل كامل.

لقد خطرت لنا فكرة هذا النهج لأول مرة عندما أدركنا أهمية تطبيق التحفيز الميكانيكي الفسيولوجي لتجديد البنى الهندسية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن عمليات المفاعل الحيوي يصعب تعلمها بسبب تعدد خطواتها، ولا يمكن اكتسابها إلا من خلال عرض تفصيلي. للبدء، استخدم الماء المقطر لتنظيف مقاطع بطول 30 centimeter من أنابيب السيليكون ذات القطر الداخلي 3 millimeter واتركها تجف في الهواء.

استخدم مقصاً لقص قطعة من شبكة PGA بمقاس 1.1 سنتيمتر في ثمانية سنتيمتر لكل قطعة من الأنابيب باستخدام ملقط جراحي، ثم قم بتثبيت شبكة PGA بالأنابيب باستخدام خيط جراحي Dexon 6.0 عبر عقد ثلاث عقد جراحية تليها غرز فردية باستخدام الملقط الجراحي، وبذلك تشكل الشبكة المثبتة سِقالة من الـ PGA. اغسل السقالات عن طريق غمرها أولاً في هيدروكسيد الصوديوم بتركيز one molar لمدة دقيقة إلى دقيقتين، ثم غمرها ثلاث مرات في الماء المقطر لمدة دقيقتين لكل غمرة. جففها برفق بين عمليات الغسل واتركها لتجف في الهواء داخل خزانة سحب منخفضة (hood) لمدة 15 دقيقة بعد الغسلة الثالثة.

بعد التجفيف، قم بخياطة أطراف من مادة Dacron بطول سنتيمتر واحد على كل طرف من الشبكة باستخدام ثلاث غرز. اترك تداخلًا في الأنبوب يتراوح بين مليمتيرين إلى ثلاثة مليمترا، وتجنب ثقب الأنبوب. تأكد من ترك حوالي 15 سنتيمترًا من خيوط الخياطة الحرة لاستخدامها لاحقًا في هذا البروتوكول.

يتم تعقيم جميع مكونات وأدوات المفاعل الحيوي بجهاز الأوتوكلاف مسبقاً. وفي اليوم الذي يسبق بدء استزراع المفاعل الحيوي، يجب تجميع المفاعل الحيوي جزئياً وغمر مكوناته، والتي تشمل السقالات، والشبكة، والأنابيب السيليكونية، والأدوات الجراحية، وسلكاً رفيعاً يتجاوز طول المفاعل الحيوي، في حمام من الإيثانول بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة على الأقل أثناء الغمر. استخدم السلك لسحب الأنابيب السيليكونية عبر الأذرع الجانبية للمفاعل.

قم الآن بإخراج المفاعل الحيوي وتثبيت سحالات PGA بداخله عن طريق ربط أطواق Dacron فوق الحواف الزجاجية المتسعة. استخدم خيط الخياطة الزائد لربط كل طوق بإحكام. بعد ذلك، وباستخدام الوصلات، قم بتوصيل أنبوب السيليكون الموجود على أحد جانبي السحالة بزوج واحد من أذرع المفاعل الحيوي، وقم بتوصيل الأنبوب الموجود على الجانب الآخر من السحالة بالذراعين الآخرين.

عندما يتم تركيب الموصلات، اسحبها من الأذرع الجانبية وقم بشطف المفاعل الحيوي باستخدام الإيثانول. اترك المفاعل ينقع لمدة 10 دقائق على كل جانب. ضع المفاعل الحيوي على بعض أطباق بتري واشطفه باستخدام وسط زراعة الأنسجة.

قم بتصريف المياه. وباستخدام الماصة، تأكد أيضاً من غسل الشبكة والأنابيب. الآن، ضع قضيب تحريك معقماً في المفاعل لاستخدامه لاحقاً، وجفف الجهاز طوال الليل داخل الخزانة ذات التدفق الصفائحي مع تشغيل النافخ وإيقاف تشغيل الأشعة فوق البنفسجية من هذه النقطة فصاعداً.

تجنب الانحناء فوق المفاعل لأن ذلك قد يؤدي إلى التلوث. أثناء عملية الإعداد، يجب مسح جميع الوصلات وتنظيفها باستخدام الكحول. وقبل إجراء التوصيلات، يتم تعزيز العديد من الوصلات باستخدام البارافورم، والذي يجب نقعه في ethanol 70% قبل تطبيقه. لذا، احرص على توفير كميات كافية من كليهما.

كإجراء احترازي، ضع طبق بتري معقماً فوق كل فتحة من فتحات المفاعل الحيوي لحماية سِقالة PGA الموجودة بالداخل من الملوثات. ابدأ الآن عملية الإعداد بتوصيل منفذ الحقن بالذراع الثالث غير المستخدم في المفاعل الحيوي. بعد ذلك، قم بتوصيل كيس المحلول الوريدي (IV bag) بنظام التدفق.

باستخدام مجموعة أنابيب walrus، اربط الطرف الأزرق في أقرب نقطة ممكنة من وصلة Y ثم أغلق الأنبوب بمشبك. صِل الأنبوب الأحمر بالطرف البعيد لكيس المحلول الوريدي IV bag. بعد ذلك، صِل الأنبوب الأبيض بأحد جانبي نظام التدفق.

أدخل صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات في نظام التدفق. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب محول الضغط بصمام الإيقاف، ووصّل الطرف الآخر بالفتحة الوسطى لكيس المحلول الوريدي (IV bag). الآن، لملء نظام التدفق جزئيًا والتحقق من عدم وجود تسريبات، أضف 350 milliliters من PBS و 1%fungi zone إلى كيس المحلول الوريدي.

باستخدام حقنة سعة 60 milliliter قبل أو بعد التوصيل بنظام التدفق، اضبط الصمام للتحكم في اتجاه تدفق PBS واضغط على الكيس لشطف النظام. يمكن تنفيذ هذه الخطوة إما قبل أو بعد تثبيت الخلايا. الآن يمكن تثبيت الخلايا في المفاعل الحيوي.

في هذا المثال، قم بإعادة تعليق 8 مليون من خلايا SM، وهو ما يعادل تقريباً طبقة واحدة متصلة من T 75، في 1.25 milliliters من الوسط، ثم قم بتنقيطها بشكل منتظم على سقالة PGA من وصلة Dacron إلى وصلة Dacron. بعد إضافة الخلايا، امسح حافة المفاعل الحيوي جيداً باستخدام الكحول. تجنب الانحناء المباشر فوق المفاعل.

بعد ذلك، قم بتجميع غطاء سدادة السيليكون بعناية. تأكد من عدم تعريض الجزء السفلي من الغطاء للهواء عند إخراجه من كيس التعقيم (autoclave) أو خلال أي من خطوات التركيب التالية. أولاً، قم بتوصيل منفذ الحقن بأنبوب التغذية عند الموصل الذكري.

ثانياً، قم بتثبيت مرشحات PTFE بمسامية 0.20 micron في كل من المنافذ الثلاثة. ثالثاً، قم بتغطية منفذ الحقن بغشاء رقيق. أدخل غطاء السدادة السيليكوني المجمع في المفاعل الحيوي الزجاجي.

تأكد من أن أنبوب التغذية لا يلامس سبيكات PGA المستقرة. ثم قم بإغلاق الفوهة باستخدام البارافورم (paraform). الآن، قم بتوصيل المفاعل الحيوي بنظام التدفق، وضع المفاعل الحيوي ونظام التدفق داخل حاضنة درجة حرارتها 37 degrees Celsius.

يجب وضع المفاعل على جانبه وتدويره كل خمس دقائق لمدة تتراوح من 25 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك، وأثناء بقائه في الحاضنة، يتم ملء غرفة المفاعل الحيوي بـ 400 milliliters من أوساط زراعية من نوع 4 to 10 باستخدام مضخة عبر أنبوب تغذية. الآن، تُحضن السقالات المزروعة بدون أي ضخ نبضي لمدة ستة إلى سبعة أيام عند 37 °C مع 5% carbon dioxide.

لا داعي لتغيير الوسط أو إضافة مكملات فيتامين C خلال هذه الفترة. قبل تشغيل المضخة، افحص الأنابيب للتأكد من عدم وجود تسريبات أو التواءات. ثم اضبط معدل سرعة المضخة للحفاظ على نطاق ضغط يتراوح بين 30- و 270 mmHg. راقب هذا الضغط وحافظ عليه يومياً طوال فترة الزراعة.

يجب إجراء تغييرات الوسط الغذائي وإضافة حمض الأسكوربيك مرتين أسبوعياً أثناء نمو السقالة مع الضخ النبضي لتغذيتها بوسط جديد أولاً؛ قم بتثبيت منفذ الحقن ومرشح PTFE على أغطية التغذية لأغراض تغيير الوسط والتخلص من نفايات الوسط الغذائي. بعد ذلك، ضع أنبوب التغذية بإحكام في المضخة ثنائية الاتجاه وأدخل أحد طرفيه في منفذ التغذية بجهاز المفاعل الحيوي والطرف الآخر في غطاء التغذية. الآن، ابدأ ببطء في ضخ 200 milliliters من الوسط الغذائي.

يمكن زيادة سرعة المضخة تدريجياً. ثم قم بتوصيل أنبوب تغذية جديد وابدأ ببطء في ضخ 200 milliliters من الوسط الغذائي الطازج. ولإضافة حمض الأسكوربيك إلى المفاعل، قم بإزالة 25 milliliters من الوسط الغذائي باستخدام حقنة معقمة سعة 30 milliliter.

أضف 5 milliliters من محلول حمض الأسكوربيك المعقم ثم استعد الـ 25 milliliters. ستظهر الأوعية المهندسة كأجسام معتمة وتصل سماكة جدارها إلى 250 microns تقريباً بعد ثمانية أسابيع من الزراعة. وفي ظل ظروف النبض، يُظهر تلوين الهيماتوكسيلين والإيوسين للأوعية المهندسة تغيرات في مورفولوجيا الأنسجة مع مرور الوقت ومع عملية النبض.

يُشار إلى الجانب اللمعي للأوعية الدموية بحرف L في صبغة Masson's trichrome. وبالنسبة للكولاجين، يظهر أن الوعاء الدموي الذي خضع للنبض لمدة أربعة أسابيع يحتوي على كولاجين أكثر من نظيره غير النابض، وتشير الأسهم البيضاء إلى بقايا شظايا PGA في الأوعية بحلول الأسبوع 12. ويظهر التحليل الكيميائي المناعي تعبير مؤشر العضلات الملساء المبكر alpha actin، ومؤشر العضلات الملساء المتوسط calponin 1، ومؤشر العضلات الملساء المتأخر myosin heavy chain. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون سبع إلى ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر القيام بكل الخطوات بأقصى قدر ممكن من النظافة والتعقيم باتباع هذا البروتوكول. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل تعديل تجويف الأوعية المهندسة، للإجابة على أسئلة إضافية مثل أهمية تعديل السطح التجويفي في الحفاظ على الأوعية المهندسة أثناء الدراسات الحيوية (in vivo) بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة، وخصوصاً هندسة الأوعية الدموية، لاستكشاف الوسائل الممكنة لعلاج أمراض الشرايين التاجية في النماذج الحيوانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية الحصول على طعوم وعائية مهندسة قابلة للزرع من خلال استنبات ديناميكي لاحق. لا تنسَ أن التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم قد يكون خطيراً، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل حماية العين وارتداء معطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.